Un modelo de ratón neonatal caracteriza la transmisibilidad del SARS

Dec 18, 2023

Nature Communications volumen 14, número de artículo: 3026 (2023) Citar este artículo

2251 Accesos

39 altmétrico

Detalles de métricas

Los modelos de animales pequeños han sido un desafío para el estudio de la transmisión del SARS-CoV-2, y la mayoría de los investigadores utilizan hámsteres o hurones dorados. Los ratones tienen las ventajas de un bajo costo, una amplia disponibilidad, menos desafíos regulatorios y de cría, y la existencia de un reactivo versátil y una caja de herramientas genéticas. Sin embargo, los ratones adultos no transmiten de forma sólida el SARS-CoV-2. Aquí establecemos un modelo basado en ratones neonatales que permite la transmisión de aislados clínicos de SARS-CoV-2. Caracterizamos el tropismo, la replicación del tracto respiratorio y la transmisión del WA-1 ancestral en comparación con las variantes Alfa (B.1.1.7), Beta (B.1.351), Gamma (P.1), Delta (B.1.617.2), Omicron. BA.1 y Omicron BQ.1.1. Identificamos diferencias entre variantes en el momento y la magnitud de la eliminación de partículas infecciosas de los ratones índice, las cuales dan forma a la transmisión a los ratones de contacto. Además, caracterizamos dos SARS-CoV-2 recombinantes que carecen de los antagonistas del huésped ORF6 u ORF8. La eliminación de ORF8 desplaza la replicación viral hacia el tracto respiratorio inferior, lo que resulta en un retraso y una transmisión significativamente reducida en nuestro modelo. Nuestros resultados demuestran el potencial de nuestro modelo de ratón neonatal para caracterizar los determinantes virales y del huésped de la transmisión del SARS-CoV-2, al tiempo que revelan el papel de una proteína accesoria en este contexto.

A pesar de los esfuerzos de vacunación a nivel mundial y la creciente inmunidad natural, las variantes emergentes del SARS-CoV-2 continúan infectando y afectando la salud de millones de personas. Las variantes anteriores que causaron preocupación incluyen Alpha (B.1.1.7), Beta (B.1.351), Gamma (P.1), Delta (B.1.617.2) y Omicron (B.1.1.529), mientras que Omicron sub- El linaje XBB.1.5 domina actualmente la primera mitad de 20231. Las variantes difieren en genes clave en todo el genoma viral, incluidos Spike (S), ORF1a, ORF1b, Nucleocápside (N), ORF3a, ORF6, ORF7a, ORF8, ORF9b, Envoltura (E ) y Membrana (M). Se ha prestado mucha atención a los cambios en Spike, ya que esta glicoproteína de la envoltura es el antígeno al que se dirigen la mayoría de las estrategias de vacunación hasta la fecha2 y es clave para la entrada viral en las células3. Otros puntos clave que acumulan mutaciones en las variantes del SARS-CoV-2 son las proteínas accesorias, de las cuales el SARS-CoV-2 codifica 8, y algunas sirven como antagonistas de la respuesta antiviral del huésped, en particular la producción y respuesta del interferón tipo I4,5,6 . Nuestro conocimiento de los ORF del SARS-CoV-2 proviene de la inferencia de similitudes funcionales con el SARS-CoV-1 y otros coronavirus, así como de estudios funcionales que utilizan construcciones de sobreexpresión de ADNc de ORF o SARS-CoV-27,8,9,10 recombinante completo. El elevado número de infecciones por SARS-CoV-2 que coincidió con la aparición de nuevas variantes generó preocupación sobre una mayor transmisión de estas variantes, lo que plantea ramificaciones considerables para la resolución de la pandemia de COVID-1911.

La caracterización molecular de las variantes del SARS-CoV-2 es esencial para nuestra capacidad de desarrollar estrategias antivirales apropiadas. Estudios anteriores han caracterizado las variantes del SARS-CoV-2 evaluando la unión y la afinidad del receptor, la dinámica de replicación y escape antigénico, así como la patogénesis y la evasión inmune12,13. Sin embargo, los estudios comparativos sobre la transmisión de variantes y los mecanismos moleculares que gobiernan las diferencias de transmisión específicas de variantes aún son escasos. Esto se debe en parte a las limitaciones inherentes a los modelos animales actuales, como los hurones o los hámsteres. Si bien son excelentes modelos para el estudio de la patogénesis y transmisión del SARS-CoV-214,15,16, requieren alojamiento especial, el número de animales de contacto por índice es limitado, carecen de reactivos específicos de cada especie y tienen una disponibilidad limitada o nula de información genética. manipulación para realizar estudios mecanicistas sobre los factores de transmisión del huésped. Por el contrario, los ratones ofrecen una caja de herramientas genéticas versátil y fácilmente disponible, y los reactivos están ampliamente disponibles; sin embargo, los ratones adultos no transmiten eficientemente virus respiratorios, como los virus de la influenza, a pesar de ser susceptibles a la infección17. Anteriormente superamos este obstáculo para el virus de la influenza utilizando ratones neonatales17, un modelo que se ha utilizado para estudiar la infección bacteriana durante más de 30 años18,19 y la transmisión durante 7 años17,19,20,21,22. El modelo también ha sido aplicado con éxito por otros investigadores para estudiar la transmisión del parvovirus en ratones23. Nuestro estudio anterior reveló diferencias en la transmisión específica de la cepa del virus de la influenza, el papel de la inmunidad humoral en la protección de la transmisión del virus de la influenza y la influencia de la expresión de sialidasa durante la coinfección por el virus de la influenza y Streptococcus pneumoniae17. Sin embargo, el modelo no está establecido para el SARS-CoV-2.

Aquí, presentamos un modelo de ratón neonato K18-hACE2 que permite la transmisión del SARS-CoV-2 entre cachorros de la misma camada, y examinamos en paralelo la transmisión de las variantes preocupantes tempranas y actuales del SARS-CoV-2. (COV). Además, caracterizamos la transmisión de dos SARS-CoV-2 recombinantes, que carecen de proteínas accesorias ORF6 u ORF8. Nuestro estudio destaca el poder de nuestro modelo para dilucidar la dinámica de la transmisión de la variante del SARS-CoV-2 y proporciona evidencia de que una proteína accesoria, ORF8, es fundamental para la transmisión del SARS-CoV-2 en ratones neonatales. Nuestro modelo manejable de animales pequeños ayudará a descifrar algunos de los factores más críticos involucrados en la transmisión del SARS-CoV-2.

Si bien los virus de la influenza infectan fácilmente a ratones de tipo salvaje, el ancestral SARS-CoV-2 y la variante delta, previamente clínicamente importante, dependen de la versión humana del receptor de la célula huésped del SARS-CoV-2, ACE2, y no pueden activar el Ace224 murino. Por el contrario, varias otras variantes del SARS-CoV-2 adquirieron mutaciones Spike específicas, en particular N501Y, que les permite unirse al Ace225 murino. En última instancia, nuestro objetivo era comparar un panel de variantes, desde Alpha hasta Omicron, con el ancestral SARS-CoV-2. Teniendo esto en cuenta, utilizamos ratones K18-hACE2 en nuestro estudio, que expresan ACE2 humana bajo el control del promotor K1826.

Para el SARS-CoV-2, los datos sobre la transmisión en ratones adultos son escasos; un estudio informa la transmisión del SARS-CoV-2 B.1.351 (Beta) de ratones índice infectados con 5E6 FFU a través de contacto cercano27. La transmisión entre ratones cohabitados en la misma jaula, determinada por la presencia de ARN viral o la seroconversión de los contactos, fue del 41 y el 8%, respectivamente. No se evaluó el virus infeccioso. La transmisión de los virus de la influenza en ratones adultos también ha sido ineficiente e inconsistente, siendo difícil reproducir los eventos de transmisión entre los grupos de investigación17,28,29. Esto convirtió al modelo de ratón adulto en una herramienta poco confiable para estudiar la transmisión de los virus de la influenza. Para determinar la eficiencia de la transmisión del SARS-CoV-2 en ratones adultos en nuestras manos, infectamos ratones índice K18-hACE2 de 13 semanas de edad por vía intranasal, bajo anestesia, con una dosis letal (10.000 UFP titulada en VeroE6-TMPRESS2-T2A- Células ACE2) del SARS-CoV-2 ancestral USA_WA-1/2020 (WA-1). A partir del día de la infección, alojamos conjuntamente a los ratones índice infectados con contactos ingenuos en una proporción de 1 índice por 2 a 3 contactos (Figura complementaria 1a). Monitoreamos la morbilidad (pérdida de peso) y la mortalidad (criterio de valoración humanitario) y recolectamos muestras de secreción nasal longitudinal de forma no invasiva y sin anestesia, sumergiendo las fosas nasales en medios virales. Por lo tanto, pudimos aprovechar la cinética de la eliminación del tracto respiratorio superior (URT) en ratones individuales, longitudinalmente, como medida de infección viral. A diferencia de los ratones índice, no observamos morbilidad o mortalidad en los ratones de contacto al final del experimento (10 días después de la infección del índice) (Figura complementaria 1b, c). Los ratones índice eliminan partículas infecciosas a partir del día 1 al 6 después de la infección, con una eliminación viral máxima en el día 2 (Figura complementaria 1d). Detectamos virus infecciosos en muestras de excreción de URT en cualquier momento en solo 1/9 (11% en total) de los animales en contacto (Figura complementaria 1d). Este era el mismo animal de contacto que todavía tenía títulos infecciosos en la URT y el pulmón a 10 ppp (Figura complementaria 1e). Por jaula, esto representó 0/3 (0%), 0/3 (0%) o 1/3 (33%) de eficiencia de transmisión. En un experimento paralelo, determinamos la transmisión por seroconversión de contacto (Figura complementaria 1f). Los ratones infectados con PBS sirvieron como control negativo y los ratones infectados con una dosis subletal (1000 PFU) como control positivo para la seroconversión. En el criterio de valoración experimental de 22 días después de la infección del índice, encontramos que 1/5 (20%) de los ratones en contacto se habían seroconvertido (Figura complementaria 1f). Por jaula, esto representó 0/3 (0%) o 1/2 (50%) de transmisión. Concluimos que la transmisión por contacto de WA-1 en ratones adultos K18-hACE2 ocurre, aunque con baja eficiencia y con una alta variabilidad de una jaula a otra. Por lo tanto, al igual que el modelo de transmisión del virus de la influenza, a continuación nos propusimos establecer la infección por SARS-CoV-2 en ratones recién nacidos.

Primero realizamos un experimento de dosis-respuesta para determinar la dosis viral mínima necesaria para producir una infección y diseminación robustas del SARS-CoV-2 en los recién nacidos. Combinamos machos C57BL/6 K18-hACE2+/+ y hembras C57BL/6 (hACE2-/-) para producir descendencia K18-hACE2+/- permisiva para SARS-CoV-2 WA-1. A los 4-7 días de edad, los cachorros se infectaron por vía intranasal con 3 µl de WA-1 ancestral sin anestesia. Utilizamos una dosis viral creciente de 1.500, 15.000 o 50.000 UFP. Luego monitoreamos la morbilidad (falta de aumento de peso) y la mortalidad (criterio de valoración humanitario) y recolectamos muestras diarias de secreción nasal longitudinal sumergiendo las fosas nasales en medios de recolección (Figura complementaria 1g). Los cachorros infectados con 1500 UFP no lograron ganar más peso el día 3 después de la infección (3 ppp) y todos sucumbieron a la infección a los 4 ppp. Los cachorros infectados con 15 000 o 50 000 UFP murieron a los 3 ppp antes de que se produjera una pérdida de peso detectable (Figura complementaria 1h, i). Los títulos de eliminación nasal entre cachorros infectados con 1500, 15 000 o 50 000 UFP fueron similares en 1 y 2 ppp, pero se hicieron evidentes en 3 ppp (Figura complementaria 1j): los títulos de cachorros infectados con 1500 UFP disminuyeron en comparación con 2 ppp, mientras que los títulos de cachorros infectados con 15 000 UFP se mantuvo en el mismo nivel que 2 ppp, y los títulos de cachorros infectados con 50 000 UFP aumentaron más allá de lo detectado a 2 ppp. La diferencia detectada en el título de eliminación entre los grupos de 1.500 y 50.000 UFP a 3 ppp fue aproximadamente 100 veces mayor. Esto muestra que un título de entrada creciente puede modular la dinámica de la eliminación viral en nuestro modelo. Como la dosis más baja probada de 1500 UFP produjo una infección sólida y dejó un día adicional para que se produjera la transmisión antes de que los ratones índice sucumbieran a la infección, utilizamos 1500 UFP como inóculo estandarizado en experimentos posteriores de infección neonatal en ratones.

A continuación, probamos la transmisión de WA-1 dentro de la camada en ratones neonatales. Infectamos ratones índice K18-hACE2+/- de 4 a 7 días de edad con 1500 UFP de WA-1 y los colocamos nuevamente con la madre (no permisiva) y sus compañeros de camada (permisivos) ingenuos en una proporción de 1 índice por 4-6 contactos. ratones (Fig. 1a). Primero observamos que tanto la morbilidad como la mortalidad se compensaron en los ratones de contacto entre 2 y 3 días en comparación con los ratones índice (Fig. 1b, c), lo que indica una transmisión exitosa. En ratones índice, detectamos ARN del SARS-CoV-2 tan pronto como 1 ppp, con un máximo de 2 ppp, mientras que algunos cachorros de contacto comenzaron a eliminar ARN viral a partir de 2 ppp, con un máximo de 4 ppp (Fig. 1d). Un experimento paralelo con SARS-CoV-2 inactivado por calor mostró que los genomas virales en las muestras de eliminación se debían a la replicación viral activa y no al arrastre de los inóculos (Figura complementaria 1k). Por tanto, la detección del ARN del SARS-CoV-2 en ratones en contacto fue otro indicio de transmisión. Sin embargo, definimos estrictamente la transmisión como la detección sostenida de partículas virales infecciosas en ratones en contacto. Por lo tanto, determinamos los títulos virales en muestras de secreción nasal mediante ensayo de placa. Las partículas infecciosas de ratones índice (Fig. 1e) se correlacionaron con el inicio y la disminución de la detección de ARN (Fig. 1d). La detección de partículas infecciosas en cachorros de contacto confirmó la transmisión del SARS-CoV-2. Las partículas infecciosas en los contactos alcanzaron su punto máximo el día 4 y disminuyeron en los días 5 y 6, similar a las tendencias del ARN del SARS-CoV-2. Es de destacar que todos los cachorros de contacto arrojaron partículas infecciosas antes del día 4, lo que representa 16/16 (100%) de transmisión de WA-1 en nuestro modelo.

a Cachorros K18-hACE2+/- de cuatro a siete días de edad se infectaron por vía intranasal con 1500 UFP de SARS-CoV-2 WA-1 y se alojaron conjuntamente con compañeros de camada no infectados durante 6 días. El peso y la supervivencia se controlaron diariamente y se recogieron muestras de eliminación viral sumergiendo diariamente las fosas nasales de cada cachorro en medio viral. Datos de dos repeticiones independientes, con un total de n = 4 índices y n = 9 ratones de contacto. Peso corporal medio (b) y supervivencia (c) de las crías índice y de contacto. Carga viral en muestras de eliminación analizadas mediante RT-qPCR para ARN del SARS-CoV-2 (d) y mediante ensayo de placa para virus infecciosos (e). Los datos se muestran como media geométrica (línea) con desviación estándar geométrica (área sombreada). Los valores individuales por debajo del límite de detección (50 UFP/ml) se establecieron en 5. f Inmunohistoquímica para la proteína N del SARS-CoV-2 en la nasofaringe de ratones de 4 a 7 días de edad. Las crías se infectaron por vía intranasal con 1500 UFP de SARS-CoV-2 WA-1, y las cabezas se fijaron a 2 ppp, se incluyeron en parafina, se seccionaron a través de la nasofaringe y se tiñeron para detectar la proteína N del SARS-CoV-2 (amarillo) y DAPI (azul). ) para núcleos. Las flechas representan áreas ampliadas en los paneles adyacentes. OE y RE indican epitelio olfatorio y epitelio respiratorio, respectivamente. Creado con BioRender.com.

La detección de partículas infecciosas en muestras de excreción de ratones neonatales K18-hACE2 sugirió una fuerte infección viral en la URT. Para determinar los sitios de infección dentro de la URT en granularidad espacial, realizamos inmunohistoquímica (IHC) en la nasofaringe de cachorros índice. Se recolectaron cabezas de ratones neonatales en su punto máximo de eliminación viral (2 ppp), se seccionaron a través de la nasofaringe y se tiñeron para detectar la proteína N del SARS-CoV-2. Detectamos células positivas para SARS-CoV-2 en el revestimiento del epitelio respiratorio y olfativo superior, lo que demuestra la replicación de SARS-CoV-2 WA-1 en células de la URT (Fig. 1f). En conjunto, estos resultados establecen y validan un modelo de ratón neonatal K18-hACE2 manejable para la transmisión del SARS-CoV-2.

Se ha propuesto que la alta transmisibilidad de las variantes Alfa y Delta del SARS-CoV-2 se debe a una replicación y eliminación eficiente de la URT30,31. Esto contrasta con la literatura sobre el virus de la influenza, donde la replicación de la URT no se correlaciona con la generación o transmisión de aerosoles en humanos32. Utilizando el modelo de ratón neonato, recapitulamos experimentalmente que la eficiencia de transmisión del virus de la influenza no se correlaciona con los títulos de URT, sino más bien con la cantidad de virus exhalado en las secreciones derramadas17. Otros han demostrado que la transmisión del virus de la influenza depende tanto del momento como de la magnitud del pico de eliminación33,34. Se observaron observaciones similares para el SARS CoV-2 en hámsteres sirios, donde los títulos de virus orales de los hisopos eran un indicador pobre de la diseminación por el aire, aunque el pico de virus transmitido por el aire en el medio ambiente se correlacionaba con la transmisión35.

Para identificar los correlatos del índice de transmisión del SARS-CoV-2 en nuestro modelo, caracterizamos las cargas virales en varios compartimentos respiratorios: tracto respiratorio inferior (homogenados pulmonares), URT (lavados traqueales retro) o secreciones eliminadas (virus expulsados). Comenzamos evaluando la dinámica de replicación viral dentro de estos compartimentos para el virus ancestral WA-1. Se infectaron cachorros K18-hACE2+/- de 4 a 7 días de edad con 1500 UFP de WA-1 y se midió la carga de partículas infecciosas en el tipo de muestra respectivo a 1, 2 y 3 ppp (Fig. 2a, b, Fig. Suplementaria 2a). . A 1 ppp, los títulos expulsados ​​y URT fueron mayores que los títulos pulmonares, aunque no estadísticamente significativos. A 2 ppp, los títulos expulsados, URT y pulmonares fueron similares entre sí. A 3 ppp, los títulos de eliminación disminuyeron, mientras que los títulos pulmonares aumentaron, lo que resultó en títulos pulmonares significativamente más altos que los títulos de eliminación. Esto sugiere que en nuestro modelo, la infección por SARS-CoV-2 WA-1 administrada en bajo volumen por vía intranasal sin anestesia progresa desde la URT a los pulmones con el tiempo.

a Se infectaron ratones neonatales K18-hACE2+/- con el SARS-CoV-2 indicado y se recogieron muestras de eliminación viral diariamente. A 2 ppp, se recogieron lavados retrotraqueales y pulmones para determinar los títulos virales y se fijaron las cabezas para inmunohistoquímica. b – g Carga viral en muestras de excreción diaria (izquierda) y a 2 ppp en muestras de excreción, tracto respiratorio superior y pulmones (derecha). Los valores individuales por debajo del límite de detección (LOD, 50 PFU/ml) se establecieron en 5. Datos de al menos 2 repeticiones independientes con n = 6 - 15 cachorros por grupo. Sólo se presentan valores de p significativos (prueba de Kruskal-Wallis). h Inmunohistoquímica para SARS-CoV-2 N a 2 ppp en nasofaringe. Creado con BioRender.com.

A continuación, comparamos la dinámica de eliminación de URT de virus ancestrales y variantes. Primero generamos reservas de trabajo virales clonales (purificadas con placa), purificadas con sacarosa y secuenciadas en profundidad. Este riguroso proceso de control de calidad garantiza la identidad de los COV (es decir, la presencia de mutaciones que definen variantes) y su integridad (la falta de mutaciones inducidas por cultivos de tejidos). Luego infectamos cachorros K18-hACE2+/- con 1500 UFP de Alpha (B.1.1.7), Beta (B.1.1.351), Gamma (P.1), Delta (B.1.617.2), Omicron BA. .1 u Omicron BQ.1.1. Primero determinamos la dinámica de la eliminación del virus infeccioso para cada aislado de 1 a 4 ppp o hasta que los cachorros sucumbieron a la infección (Fig. 2a, Fig. Suplementaria 3). La excreción de ratones infectados con WA-1 ancestral alcanzó su punto máximo a 2 ppp antes de disminuir en 3 ppp (Fig. 2b). A diferencia de WA-1, la eliminación de ratones infectados con Alpha alcanzó su punto máximo antes, a 1 ppp, y disminuyó drásticamente en 2 ppp (Fig. 2c). La eliminación de ratones infectados con Beta también alcanzó un máximo de 1, pero, a diferencia de Alpha, permaneció en el mismo nivel en 2 ppp antes de disminuir en 3 ppp, lo que resultó en un título similar al de los cachorros infectados con WA-1 (Fig. 2d). La eliminación de ratones infectados con Gamma y Delta tuvo una pendiente similar a WA-1, con un pico a 2 ppp, antes de disminuir en 3 ppp (Fig. 2e, f). Los títulos de eliminación de cachorros infectados con Gamma fueron en promedio más bajos que los de cachorros infectados con WA-1, aunque no estadísticamente significativos (Fig. 2e). Los ratones infectados con los aislados de Omicron BA.1 o BQ1.1 eliminaron niveles generales bajos de virus, con la mayoría de las réplicas por debajo del límite de detección (Fig. 2g, Fig. Suplementaria 2d). Sin embargo, estas dos variantes de Omicron difieren con respecto a la cinética de desprendimiento: el desprendimiento de BQ.1.1 alcanzó su punto máximo a 1 ppp versus BA.1 a 3 ppp (Fig. 2g, Fig. Suplementaria 2d). Por lo tanto, nuestro modelo es capaz de capturar la cinética única de la eliminación de la URT variante del SARS-CoV-2 de cachorros infectados.

Luego comparamos los sitios de replicación viral para cada variante y encontramos que la distribución de la carga viral en diferentes tipos de muestras es distinta para virus específicos. Para Alpha, los títulos de desprendimiento y URT a 2 ppp fueron comparables en magnitud a 2 ppp WA-1 (Fig. 2b, c), pero los títulos pulmonares tenían una tendencia a la baja (Fig. 2c). Para determinar si estos títulos pulmonares más bajos fueron una consecuencia del inicio más temprano y la disminución de la replicación y la eliminación de Alpha, analizamos las cargas virales de Alpha en los tres compartimentos también en el día pico de eliminación de Alpha, 1 ppp (Figura complementaria 2b, panel izquierdo). Nuevamente, encontramos títulos significativamente más altos en las muestras de eliminación y URT que en los pulmones, lo que sugiere que, en nuestro modelo, tanto en 1 como en 2 ppp, Alpha se replica mejor en la URT. Para Beta, Gamma y Delta no encontramos diferencias significativas en los títulos entre el virus diseminado, la URT y los pulmones, lo que sugiere una capacidad igual para infectar y replicarse tanto en la URT como en el tracto respiratorio inferior y para ser eliminado de la URT (Fig. 2d). -F). De hecho, la IHC de la región URT confirmó que WA-1, Alpha, Beta, Gamma y Delta infectan la URT de manera eficiente (Fig. 2h). Por el contrario, los títulos de BQ1.1 en URT y pulmones a 2 ppp fueron indetectables (Fig. 2g), y la IHC no reveló células infectadas con Omicron BQ.1.1 en el epitelio de URT (Fig. 2h). Para determinar si estos títulos indetectables fueron consecuencia del inicio más temprano y la disminución de la replicación y eliminación de BQ1.1, analizamos las cargas virales de Omicron BQ.1.1 en los tres compartimentos también en su día pico de eliminación, 1 ppp. Descubrimos que los títulos promedio todavía eran bajos en los tres compartimentos y que algunas muestras estaban por encima del límite de detección en muestras de eliminación y URT (Figura complementaria 2c). Estos resultados fueron similares a los datos de 1 ppp obtenidos para Omicron BA.1 (Figura complementaria 2e, f). No se detectaron partículas infecciosas de Omicron en los pulmones para ninguna de las subvariantes de Omicron, lo que sugiere que Omicron no se replica eficientemente en ratones neonatales K18-hACE2 (Fig. 2g, Fig. Suplementaria 2e). Nuestros resultados están en línea con los hallazgos de otros, que muestran que las variantes de Omicron están atenuadas en hámsteres y ratones, a pesar de la presencia de su receptor hACE2 en el modelo K1824,36,37.

Curiosamente, las cargas virales en las muestras de excreción fueron similares a las de sus respectivas muestras de lavado retrotraqueal para todos los aislados virales, lo que demuestra que, en nuestro modelo, los virus SARS-CoV-2 analizados no muestran un defecto en la expulsión viral y, por lo tanto, la URT la eliminación se puede utilizar como proxy para la replicación de URT del SARS-CoV-2.

En conjunto, nuestros resultados demuestran que, a excepción de las variantes de Omicron, nuestro modelo permite la replicación y eliminación eficiente de las variantes del SARS-CoV-2 en niveles comparables a los del ancestral WA-1. La cinética de eliminación temporal difiere entre las variantes y permite que este modelo se utilice como herramienta para comprender los mecanismos de transmisión de la variante SARS-CoV-2.

A continuación, utilizamos nuestro panel de variantes del SARS-CoV-2 que van desde los aislamientos pandémicos tempranos hasta los actuales para probar la transmisión. Se infectaron ratones índice K18-hACE2+/- de 4 a 7 días de edad con SARS-CoV-2 WA-1 ancestral, Alpha, Beta, Gamma, Delta, Omicron BA.1 u Omicron BQ.1.1 y se alojaron con ratones neonatales sin tratamiento previo. ratones en una proporción de 1:6-9. Los ratones índice infectados con WA-1, Alfa, Beta y Delta sucumbieron a la infección a los 3 ppp (Figuras complementarias 3a-c, e). Los ratones índice infectados con gamma sucumbieron a los 4 ppp (Figura complementaria 3d). Para los ratones índice infectados con Delta y Omicron BA.1, la morbilidad (falta de aumento de peso) y la mortalidad se retrasaron, y para los ratones índice infectados con Omicron BQ.1.1, no detectamos una morbilidad sustancial pero sí una mortalidad completa, aunque retrasada, de ratones índice (Figuras complementarias 3e-g). Los eventos de transmisión que ocurren en momentos tardíos, después de la muerte de las crías índice, pueden deberse a un inicio tardío de la eliminación de contactos o a una transmisión secuencial entre contactos. A excepción de las dos variantes de Omicron, algunos o todos los ratones en contacto en jaulas con otras variantes sucumbieron a la infección a los 7 ppp (Figura complementaria 3).

A continuación, investigamos la dinámica de la transmisión utilizando dos lecturas no redundantes de cachorros de contacto: 1. Momento de la adquisición viral por los contactos: cuantificamos la adquisición de virus por los cachorros de contacto como "eventos de transmisión" cuando el virus se detecta al menos dos veces en las muestras de excreción (Fig. .3). El primer día de eliminación viral de cada contacto (“virus infeccioso positivo”) se cuenta como el inicio de la adquisición. Esto nos permite evaluar la adquisición viral en función del tiempo y comparar la cinética de adquisición entre variantes. Sin embargo, esta lectura no representa la amplitud de la infección por contacto. 2. Detección de títulos virales por excreción de URT de animales de contacto: esta medida permite la detección de variaciones sutiles en el nivel de excreción de contacto. Las diferencias en la amplitud de la eliminación observadas en nuestros experimentos pueden deberse a las variaciones en la eliminación de los ratones índice (es decir, la dosis infecciosa y el momento de la transmisión por parte del índice) y/o diferencias en la capacidad replicativa viral en los contactos. Los cambios en los títulos de eliminación de contactos pueden ser importantes en experimentos de transmisión secuencial, donde los contactos se convierten en índices para individuos ingenuos. Para WA-1 y Alpha, la transmisión del 100 % se alcanzó con 3 o 4 ppp, respectivamente, con pendientes que no fueron significativamente diferentes (Fig. 3a, panel izquierdo). Tanto las partículas infecciosas ancestrales WA-1 como Alpha se detectaron en algunos ratones de contacto tan pronto como 1 ppp, y las de Alpha fueron significativamente más altas que las de WA-1 en 3 ppp, lo que sugiere una ligera ventaja de transmisión por parte de Alpha. Los títulos de eliminación de contacto alfa alcanzaron su punto máximo a los 4 ppp y se desvanecieron antes que WA-1, comenzando a los 4 ppp (Fig. 3a, panel derecho), lo que está en línea con la caída temprana de los títulos de eliminación observada previamente en ratones con índice Alfa (Fig. .2c). A diferencia de Alpha, los ratones de contacto Beta mostraron una adquisición significativamente retrasada en comparación con WA-1 (Fig. 3b, panel izquierdo), pero alcanzaron títulos de contacto máximos similares (Fig. 3b, panel derecho). Los ratones de contacto gamma mostraron una adquisición significativamente retrasada en comparación con WA-1 (Fig. 3c, panel izquierdo) y lograron una transmisión general del 73%. Los ratones de contacto gamma también tuvieron una carga viral general más baja, aunque la cinética hacia y desde el título máximo fue similar a la de WA-1 (Fig. 3c, panel derecho). Al igual que Gamma, los ratones de contacto Delta se retrasaron significativamente con los ratones de contacto WA-1 con respecto a la adquisición (Fig. 3d, panel izquierdo), y los niveles máximos de virus infecciosos de los contactos Delta fueron similares a los de WA-1 (Fig. 3d, panel derecho). Los contactos infectados con Delta continuaron liberando partículas infecciosas hasta el final del experimento a 7 ppp (Fig. 3d, panel derecho). Los ratones de contacto con Omicron BA.1 no adquirieron infección en nuestro modelo ni eliminaron virus infecciosos (Fig. 3e), lo que concuerda con otros informes que muestran que Omicron BA.1 está atenuado y la transmisión aérea se reduce en roedores24,36,37 ,38. Curiosamente, y a diferencia de BA.1, los ratones de contacto Omicron BQ.1.1 lograron una transmisión del 25% en nuestro modelo (Fig. 3f, panel izquierdo). BQ.1.1. índice derramado con títulos virales excepcionalmente bajos (Fig. 2g) que se correspondían con una tasa de transmisión más baja y una baja diseminación por contacto (Fig. 3f, panel derecho). La diferencia de transmisión entre BA.1 y BQ.1.1 fue sorprendente dado que los títulos máximos de eliminación de ambas subvariantes de Omicron en animales índice fueron igualmente bajos (Fig. 2g, Fig. Suplementaria 2c). Es posible que el momento de la eliminación máxima (1 ppp para BQ.1.1 frente a 3 ppp para BA.1) sea el determinante crítico para la transmisión de Omicron en nuestro modelo. En general, nuestros datos muestran que la magnitud de la pérdida de índice se corresponde con el éxito de la transmisión a los contactos (Figura complementaria 2g).

Se infectaron ratones neonatales K18-hACE2+/- con el SARS-CoV-2 indicado y se alojaron conjuntamente con compañeros de camada no infectados durante 7 días en una proporción de 1:6-9. Se controló diariamente la adquisición de infección y la carga viral en ratones en contacto. Ancestral WA-1 se comparó con las variantes Alpha (a), Beta (b), Gamma (c), Delta (d), Omicron BA.1 (e) y Omicron BQ1.1 (f). Los paneles de la izquierda muestran el porcentaje de adquisición viral en gráficos de Kaplan-Meier invertidos. El inicio de la adquisición se calificó como el primer día de detección sostenida del virus infeccioso. Los paneles de la derecha muestran la carga viral en muestras de excreción por contacto determinada mediante ensayo de placa. Los datos se muestran como media geométrica (línea) con desviación estándar geométrica (área sombreada). Los valores individuales por debajo del límite de detección (50 UFP/ml) se establecieron en 5. Datos de al menos 2 repeticiones independientes n = 1 índice y 4-6 cachorros de contacto por repetición. Sólo se presentan valores de p significativos (prueba de rangos logarítmicos de Mantel-Cox para gráficos de Kaplan-Meier, prueba de Kruskal-Wallis para carga viral).

A continuación, caracterizamos el repertorio inflamatorio URT de ratones índice después de la exposición viral en nuestro modelo. Se espera que una respuesta antiviral/inflamatoria a la infección atenúe el virus dentro del huésped, provocando una reducción de la transmisión5,39. Sin embargo, el aumento de la inflamación también puede inducir secreciones de URT que ayudan a expulsar el virus al medio ambiente, lo que puede favorecer la transmisión20,22. Analizamos las citocinas presentes en muestras de ratones índice con eliminación de URT mediante ELISA múltiple a las 6, 24 y 48 h, utilizando SARS-CoV-2 WA-1 inactivado por calor (HI) o poli (I:C) como controles. Detectamos la presencia de múltiples citocinas en ratones tratados con poli (I: C) en el momento de las 48 h, aunque en niveles más bajos que en los ratones infectados con WA-1 (Figura complementaria 4a). HI WA-1 no logró inducir una inflamación mensurable en todos los puntos de tiempo, mientras que detectamos niveles elevados de citoquinas en muestras de ratones infectados con WA-1 a las 48 h (Figura complementaria 4a). Esto sugiere que nuestras reservas virales purificadas no contienen material inflamatorio exógeno, que se requiere la replicación activa de WA-1 para impulsar la inflamación en nuestro modelo y que el punto de tiempo de 48 h es óptimo para medir el perfil de citocinas en muestras de eliminación de URT.

Para explorar una posible asociación entre la inflamación y la transmisión de la URT índice, medimos las citocinas en muestras excretadas de ratones índice infectados con el SARS-CoV-2 WA-1 ancestral o las variantes Alfa, Beta, Gamma, Delta, Omicron BA.1 y Omicron BQ. .1.1 a 48 hpi. Títulos comparables de eliminación de virus infecciosos en este momento para la mayoría de las variantes, entre 104 y 105 PFU/ml (Fig. 2), permitieron una comparación cualitativa de las firmas de citoquinas entre estos virus que se replican igualmente. Ambas variantes de Omicron tuvieron títulos de eliminación viral mucho más bajos a 48 hpi (101 PFU/mL, Fig. 2g) y, en consecuencia, las firmas de citocinas para ambas variantes de Omicron a 48 hpi fueron silenciosas (Fig. 4b complementaria). En particular, a las 24 hpi, que es el momento máximo de eliminación de BQ.1.1, detectamos niveles elevados de citocinas en el índice infectado con BQ.1.1 (Fig. 2g, Datos ampliados 4c), pero no encontramos tal aumento en BA.1- ratones infectados, donde la muda alcanza su punto máximo más tarde, a 72 hpi (Figura complementaria 2d, Figura complementaria 4c). Para virus que se replican por igual (WA-1, Alfa, Beta, Gamma y Delta), encontramos que la firma de citocinas en la infección ancestral por WA-1 era la más diferente de las firmas en la infección con variantes (Figura complementaria 4b). Las firmas Gamma y Alfa se agruparon, al igual que las firmas Alfa y Delta, respectivamente. El conjunto de citocinas clave con regulación positiva fue similar entre virus que se replicaban igualmente (Figura complementaria 4b, cuadrante superior izquierdo), pero la amplitud de la regulación positiva difirió entre los virus. En particular, la distancia del grupo de citocinas de los diferentes virus se correlacionó con su respectiva eficiencia de transmisión (Figura complementaria 4d), excepto Alpha. Se necesitan más estudios para descifrar si hay alguna y, en caso afirmativo, qué citocinas URT específicas inducidas por cachorros índice contribuyen a la transmisión (Figuras complementarias 4b y 3). Nuestro modelo y la disponibilidad de ratones transgénicos con interrupciones en vías clave de citocinas nos permiten realizar estos estudios futuros.

En conjunto, nuestros resultados muestran que nuestro modelo de ratón neonatal puede caracterizar diferencias en la dinámica de transmisión inherentes a las variantes del SARS-CoV-2. Nuestro método diario de muestreo viral permite rastrear la replicación viral en ratones índice y de contacto individuales a lo largo del tiempo, proporcionando granularidad en los parámetros de transmisión, incluida la asociación de firmas de citocinas específicas de variantes y la transmisión.

Además de las mutaciones en la espiga, varias variantes del SARS-CoV-2 muestran mutaciones en genes accesorios, como ORF3, ORF6, ORF7 y ORF8, que se han implicado en la interferencia de la señalización inmunitaria o la contrarrestación efectora directa del huésped6,8,10 ,40,41,42,43,44. La ventaja selectiva de los cambios en estas proteínas accesorias, si las hay, sigue sin definirse, especialmente en lo que respecta a la transmisión. Por lo tanto, nuestro objetivo fue determinar cómo la falta de proteínas accesorias específicas afecta la transmisión del SARS-CoV-2 en nuestro modelo y nos centramos en dos proteínas accesorias: ORF8, porque tiene mutaciones que definen las variantes Alfa, Gamma y Delta, y ORF6, que carece de mutaciones en las variantes utilizadas en este estudio pero está mutada en algunas variantes de Omicron (es decir, BA.2, BA.4), además de ser una de las proteínas accesorias del SARS-CoV-2 mejor caracterizadas1,42,43, 44. Ambos virus recombinantes se han caracterizado en células cultivadas y en ratones adultos K18-hACE245, revelando títulos virales reducidos in vitro, pero títulos pulmonares similares in vivo. Curiosamente, el virus que carece de ORF8 mostró una mayor puntuación de patología pulmonar45, lo que puede sugerir que este virus induce un mayor proceso inflamatorio.

Infectamos ratones neonatales K18-hACE2+/- con 1500 UFP de SARS-CoV-2 WA-1 recombinante (rWA-1), SARS-CoV-2 recombinante que carece de ORF6 (ΔORF6) o SARS-CoV-2 recombinante que carece de ORF8 ( ΔORF8). De manera similar a nuestras observaciones anteriores con el aislado clínico WA-1 (Fig. 2b), los títulos de eliminación de ratones con índice rWA-1 alcanzaron un máximo de 2 ppp y disminuyeron en 3 ppp (Fig. 4a, panel izquierdo). La eliminación del índice de ratones infectados con ΔORF6 fue similar a la cinética de rWA-1, con una tendencia de menor magnitud (5 veces a 2 ppp, Fig. 4b, panel izquierdo). Los ratones índice infectados con ΔORF8 eliminaron consistentemente hasta 100 veces menos virus que los ratones infectados con rWA-1 (Fig. 4c, panel izquierdo) y sobrevivieron 1 día más que el índice infectado con rWA-1 (Fig. 5a-c suplementaria), por lo tanto Todavía se cae a 4 ppp. A continuación, analizamos la replicación del virus en muestras de eliminación (virus expulsados), lavados URT (replicación URT) y pulmones (replicación del tracto respiratorio inferior) de ratones índice. Al igual que el aislado WA-1, observamos títulos de rWA-1 mucho más altos en los pulmones que en la URT y las muestras de eliminación (Fig. 4a, panel derecho). Para ΔORF6, obtuvimos títulos similares en los tres tipos de muestras, 1 × 104 PFU/mL en promedio, aunque hubo una distribución amplia y algunos cachorros mostraron títulos virales más altos en el pulmón que en las muestras de excreción o URT (Fig. 4b, derecha). panel). Concluimos que, en nuestro modelo, la falta de ORF6 no atenuó significativamente la replicación viral, su eliminación ni cambió significativamente el tropismo del tejido con respecto al rWA-1 parental. Esto fue diferente para ORF8. La eliminación de ΔORF8 y los títulos de URT fueron más bajos que para rWA-1 o ΔORF6 (Fig. 4c, panel izquierdo). Sorprendentemente, la carga viral en los pulmones fue comparable a la de rWA-1 y WA-1 ΔORF6. Esto fue similar a hallazgos previos en ratones adultos, donde la falta de ORF8 no alteró los títulos pulmonares41,45. Por lo tanto, la falta de ORF8 parece reducir significativamente la capacidad de ΔORF8 para replicarse de manera robusta específicamente en la URT.

Se infectaron ratones neonatales K18-hACE2+/- por vía intranasal con 1500 UFP de WA-1 recombinante (rWA-1), rWA-1 que carece de ORF6 (ΔORF6) o rWA-1 que carece de ORF8 (ΔORF8). ac Carga viral en muestras de excreción diaria (izquierda) y en muestras de excreción de 2 ppp, tracto respiratorio superior (URT) y pulmones (derecha). Datos de al menos n = 5 cachorros por grupo. df Porcentaje de adquisición viral mostrado en gráficos de Kaplan-Meier invertidos y carga infecciosa viral en muestras de excreción de contacto, mostrados como media geométrica (línea) con desviación estándar geométrica (área sombreada). Datos de al menos 2 repeticiones independientes con n = 1 índice y 4-6 contactos cada una. af Sólo se presentan los valores de p significativos (prueba de rangos logarítmicos de Mantel-Cox para gráficos de Kaplan-Meier, prueba de Kruskal-Wallis para carga viral). Los valores individuales por debajo del límite de detección (LOD, 50 PFU/ml) se establecieron en 5. g Mapa de calor que representa los niveles de citoquinas a 2 ppp en lavados retrotraqueales y pulmones medidos mediante ELISA múltiple. Los datos representan una inducción mayor que la de cachorros inoculados con PBS. Al menos n = 3 cachorros por condición. h Inmunohistoquímica para SARS-CoV-2 N a 2 ppp en nasofaringe.

A continuación realizamos experimentos de transmisión con los tres virus recombinantes. Al igual que el aislado WA-1, la adquisición de rWA-1 por parte de los contactos se produjo a 1 ppp, se completó a los 4 ppp y los títulos de eliminación de contactos disminuyeron de 4 ppp en adelante (Fig. 4d). ΔORF6 fue similar al rWA-1 parental tanto en el inicio de la eliminación del contacto, como en la dinámica y la adquisición (Fig. 4e). En conjunto, estos resultados sugieren que la falta de ORF6 no atenúa significativamente la transmisión en nuestro modelo. El inicio de la adquisición de ΔORF8 fue similar al de rWA-1 y ΔORF6, 1 ppp, pero a diferencia de los otros dos virus recombinantes, la pendiente de adquisición fue más lenta y la transmisión fue del 76% (Fig. 4f). Presumimos que esta reducción en la eficiencia de transmisión es una consecuencia de los títulos de eliminación más bajos de los ratones índice.

A continuación, analizamos los niveles de citocinas en URT y muestras de pulmón de ratones índice mediante ELISA múltiple (Fig. 4g). Descubrimos que los niveles de citoquinas presentes en la URT de ratones infectados con ΔORF8 tenían una magnitud similar a los infectados con rWA-1 y ΔORF6, a pesar de títulos de WA-1 ΔORF8 100 veces más bajos en el mismo momento (2 ppp). Esto sugiere una mayor firma inflamatoria de ΔORF8 en relación con la cantidad de virus presente en la URT. En los pulmones, que muestran títulos virales similares en los tres virus (Fig. 4g), observamos un patrón similar de citocinas entre los ratones infectados con ΔORF8 y rWA-1 (Fig. 4g). Cómo y si la inflamación por ΔORF8 atenúa la replicación viral específicamente en la URT, pero no en los pulmones, sigue siendo tema de mayor investigación. Es de destacar que los niveles de citocinas estaban elevados en los pulmones infectados con ΔORF6 en comparación con los pulmones infectados con rWA-1 y ΔORF8, particularmente IL-6, lo que sugiere que el virus recombinante que carece de ORF6 no puede suprimir la producción de ciertas citocinas en los pulmones de los recién nacidos. ratones.

En conjunto, nuestros resultados muestran cómo la eliminación de una proteína accesoria del SARS-CoV-2, ORF8, reduce la replicación de la URT, lo que resulta en una reducción de la excreción y transmisión en ratones neonatales. Nuestro modelo de ratón neonatal permite una visión única de estos procesos moleculares en granularidad espacial, y la disponibilidad de reactivos específicos de ratón permitirá futuros estudios mecanicistas sobre el papel de ORF8 en la replicación y transmisión de URT.

Se han utilizado ampliamente modelos de ratón de infección por SARS-CoV-2 para estudiar la patogénesis de las variantes emergentes del SARS-CoV-246,47,48,49,50,51,52. Sin embargo, los ratones adultos no transmiten de manera robusta el SARS-CoV-2 (Figuras complementarias 1a a f y ref. 27). En nuestro estudio, desarrollamos y validamos un modelo de ratón neonatal para caracterizar la transmisión de aislados humanos de SARS-CoV-2 en función de nuestra experiencia previa con el virus de la influenza A (Fig. 1 y ref. 17). Utilizando un panel único de SARS-CoV-2 que abarca aislamientos humanos pandémicos tempranos hasta actuales, demostramos cómo las mutaciones inherentes a las variantes afectan el tropismo y la diseminación (Fig. 2), la transmisión (Fig. 3) y los repertorios de citoquinas del tracto respiratorio superior (Fig. suplementaria). .4). Finalmente, nuestro estudio revela un papel previamente no apreciado para la proteína accesoria ORF8 en la replicación, inflamación y transmisión viral del tracto respiratorio superior en ratones neonatales (Fig. 4), lo que muestra el poder de nuestro modelo para estudiar los determinantes moleculares virales y del huésped del SARS. -Transmisión de CoV-2 en ratones.

Nuestro modelo tiene varias ventajas sobre los modelos animales existentes de transmisión del SARS-CoV-2: en primer lugar, la adaptabilidad a una amplia gama de animales knockout disponibles permite futuros estudios sistemáticos que determinen los factores del huésped que son críticos para la transmisión. En segundo lugar, nuestro modelo permite realizar estudios potenciados, ya que se logra más fácilmente un gran número de ratones neonatales en contacto que en otros modelos animales. En tercer lugar, hay menos desafíos de cría al trabajar con ratones en comparación con hámsteres o hurones. Además, la disponibilidad de reactivos y herramientas específicos para ratones aumenta el potencial de estudiar las vías inmunes inducidas por virus en el huésped, así como la mecánica respiratoria que podría afectar la transmisión, como el flujo de aire y la capacidad pulmonar. Finalmente, podemos seguir la progresión del índice y la infección por contacto longitudinalmente, gracias al muestreo no invasivo. Esto proporciona más granularidad y conocimiento de la cinética de la diseminación viral y la carga viral URT a nivel de individuos, lo que ilumina nuestra comprensión de la eficiencia de la transmisión.

Aunque estas características establecen nuestro modelo como una herramienta única y viable para estudiar la transmisión del SARS-CoV-2, otros modelos animales, como hámsteres y hurones, tienen ciertas ventajas sobre las limitaciones de nuestro sistema. Una limitación de nuestro modelo es que los modos de transmisión no pueden probarse experimentalmente, porque los ratones lactantes no pueden separarse entre sí ni de su madre. Es probable que la transmisión en el modelo, al igual que en los humanos53,54, se produzca mediante una combinación de modos. La transmisión por aerosoles a larga distancia, como puede ocurrir en humanos55, no se puede medir en nuestra configuración experimental actual. Sin embargo, el modelo presenta situaciones de comportamiento favorables tanto para la transmisión del virus de la influenza como del SARS-CoV-2, como se muestra tanto en humanos como en sistemas de modelos animales más clásicos: tiempo prolongado de exposición56, proximidad de individuos en espacios cerrados57 y convivencia con miembros del hogar54. 58,59,60. Además, nuestro método de recolección de muestras no invasivo de cachorros individuales nos permite medir longitudinalmente la dinámica temporal y la amplitud de la eliminación viral, ambos factores críticos en la transmisión de virus respiratorios17,33,34,61,62,63. Otra limitación de nuestro modelo es que la expresión del transgén hACE2 está impulsada por un promotor K18 no nativo, lo que permite la infección de múltiples órganos y da como resultado niveles de expresión tisular distintos del Ace249,50 murino expresado endógenamente. Aunque la expresión no es fisiológica, elegimos deliberadamente ratones K18-hACE2 para este estudio inicial de la transmisión del SARS-CoV-2 en ratones, ya que nuestro objetivo era investigar y comparar la transmisión de los aislados pandémicos tempranos y actuales, algunos de los cuales no pueden involucrar al Ace2 murino. Reconocemos que extrapolar los cambios de tropismo en nuestro modelo al tropismo en humanos justifica cautela, especialmente si estos cambios son provocados únicamente por cambios en la unión variante de pico-ACE2, es decir, a través de mutaciones en el sitio de unión del receptor de pico. Sin embargo, argumentamos que los cambios de tropismo provocados por diferencias en el procesamiento de picos y/o por diferencias en la interacción entre el virus y el huésped pueden interpretarse fácilmente utilizando nuestro modelo, ya que el transgén hACE2 no altera la expresión de proteasa ni la inflamación o el antagonismo. En conjunto, nuestro estudio demuestra cómo la selección entre los modelos animales disponibles debe basarse en el alcance y el contexto de la investigación, ya que cada uno de ellos puede proporcionar información valiosa y no redundante sobre la biología del SARS-CoV-2.

En nuestro modelo, a excepción de Omicron BA.1, observamos una transmisión de la variante del SARS-CoV-2 del 33% o más, y nuestro método fue lo suficientemente granular como para detectar diferencias sutiles entre las variantes. Por ejemplo, identificamos un pico temprano pero estrecho de replicación de URT para Alpha, lo que deja solo una ventana corta para la transmisión. A pesar de esto, los animales de contacto adquieren Alfa a un ritmo similar al WA-1 ancestral, e incluso muestran títulos de contacto significativamente más altos a 3 ppp. De hecho, Alpha fue el único virus con una eficiencia de transmisión similar o mejor que WA-1, mientras que todas las demás variantes mostraron un retraso significativo en la transmisión en comparación con WA-1. Las variantes post-Alfa surgieron después de una inmunidad generalizada en la población provocada por una infección o inmunización previa, y la evasión viral de la neutralización debido a mutaciones en el gen pico de las variantes está bien documentada64,65,66,67,68,69,70. Por lo tanto, especulamos que las diferencias de transmisión entre WA-1 y las variantes Beta a Delta pueden haber sido menos dramáticas bajo presión inmune adaptativa o incluso revelar una ventaja de transmisión para estas variantes en comparación con el virus ancestral, con el que actualmente coinciden la mayoría de los regímenes de inmunización. Los estudios futuros con este modelo introducirán presiones inmunes adaptativas mediante la vacunación de las madres antes del embarazo. La descendencia adquirirá inmunoglobulinas a través del paso transplacentario o por la leche, lo que se ha demostrado que reduce la transmisión en nuestro modelo del virus de la influenza A17.

La proteína accesoria ORF8 del SARS-CoV-2 es posiblemente la más enigmática, ya que solo comparte un 20% de identidad proteica con el SARS-CoV. Para el SARS-CoV-2, ORF8 es una glicoproteína secretada40,71,72 y se han propuesto diversas funciones inmunomoduladoras, como el mimetismo de IL-17A73,74, la interferencia con la vía del interferón tipo I43, el mimetismo de histonas75 y la regulación negativa de la clase MHC. I76,77, aunque el espectro completo de las funciones y mecanismos de acción del ORF8 aún no se ha dilucidado78. En nuestro modelo, la eliminación de ORF8 resultó en una replicación reducida específicamente en la URT. La magnitud de las citocinas inflamatorias (Fig. 4) que observamos para ΔORF8 en la URT fue similar a las del virus WA-1 o ΔORF6 parental, a pesar de que hay 100 veces menos virus en ese compartimento. Este aumento de la inflamación fue similar a observaciones previas en ratones adultos K18-hACE41,45. Es factible que, sin ORF8, el SARS-CoV-2 no pueda suprimir las respuestas antivirales críticas en la URT. Sostenemos que la replicación reducida de URT y la consiguiente disminución de la eliminación es la causa del retraso y la reducción de la transmisión de ΔORF8 en ratones. Además, argumentamos que esto no se debe a una atenuación general del SARS-CoV-2 que carece de ORF8, ya que estos virus se replican eficientemente en cultivos de tejidos y en los pulmones de ratones K18-hACE2 tanto neonatales como adultos (Fig. 4 y ref. 45). ). Hasta donde sabemos, este es el único informe hasta la fecha sobre la función específica de un compartimento de una proteína accesoria del SARS-CoV-2 en ratones. Aunque los mecanismos subyacentes del papel específico de ORF8 en la URT siguen siendo desconocidos, es posible que los procesos inflamatorios antivirales provocados por la infección por SARS-CoV-2 sean diferentes en la URT de los del tracto respiratorio inferior. Por ejemplo, el entorno celular y las diferencias de temperatura entre la URT y la LRT pueden desempeñar un papel en el comportamiento del virus y la respuesta a la infección en estos compartimentos. Además, la mala conservación del ORF8 entre los coronavirus relacionados78, la aparición de una deleción de 382 nucleótidos en el ORF8 de aislados de SARS-CoV-2 en pacientes durante febrero de 2020 y la circulación de un aislado de SARS-CoV-2 que contiene una versión truncada de ORF8 de marzo a octubre de 202079 sugiere que ORF8 es un punto crítico para la adaptación y evolución del SARS-CoV-278. Por ejemplo, la variante Alfa, que también caracterizamos en nuestro estudio, lleva un codón de parada en el aminoácido 27 de ORF8, lo que da como resultado la expresión de una proteína ORF8 truncada1. Curiosamente, en nuestro modelo, ΔORF8 y Alpha no realizaron fenocopia en términos de replicación de URT, respuestas de citocinas o transmisión. Es posible que el ORF8 truncado de alfa conserve funciones que son críticas para la replicación de URT. Otra posibilidad es que el ORF8 de alfa haya desaparecido, pero que otras proteínas virales, algunas de las cuales son diferentes del fondo WA-1, proporcionen mecanismos de supresión inmune redundantes que compensen la falta de acción del ORF8 en Alfa. Futuros estudios con SARS-CoV-2 recombinante adicional permitirán desenmarañar las diferentes hipótesis.

¿Cuáles son los determinantes de la transmisión del SARS-CoV-2 en nuestro modelo? Nuestros datos sugieren que el nivel de título de eliminación del índice infeccioso es importante con respecto a la eficiencia de la transmisión. Encontramos que los niveles más bajos de pérdida de índice se correlacionan con una eficiencia de transmisión reducida, como lo muestran las variantes de Omicron probadas y ΔORF8. Además, observamos que el momento temprano del pico en la pérdida de índice (1 ppp frente a 2 o 3 ppp) favorece la eficiencia de la transmisión, como lo demuestra la ligera ventaja de transmisión de Alpha sobre WA-1 y la clara ventaja de transmisión de Omicron BQ.1.1 sobre BA. .1. Finalmente, encontramos que los títulos virales de URT se correlacionan con los títulos de eliminación en todos los virus analizados en este estudio, lo que sugiere en general que la replicación eficiente y temprana de URT determina la eficiencia de transmisión del SARS-CoV-2 en nuestro modelo. Por el contrario, en nuestro modelo, encontramos que no había asociación entre la eliminación del SARS-CoV-2 y los títulos virales en el LRT, lo que sugiere que el virus presente en los pulmones puede ser el principal responsable de causar la enfermedad, en lugar de facilitando su transmisión.

En resumen, establecimos un modelo de transmisión del SARS-CoV-2 utilizando ratones transgénicos neonatales K18-hACE2 que caracteriza el efecto neto de las mutaciones inherentes a la variante sobre el tropismo y la transmisión viral y descubre la contribución de las proteínas accesorias a la transmisión. El uso de este modelo animal manejable para definir los mecanismos moleculares subyacentes a la transmisión del SARS-CoV-2 podría guiar el desarrollo de terapias antivirales superiores y contribuir a una mayor comprensión no solo del SARS-CoV-2, sino también de los virus respiratorios en general.

Las células Vero E6 se obtuvieron de ATCC (CRL-1586) y se cultivaron en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Gibco) suplementado con suero bovino fetal (FBS) al 10% (Atlanta Biologicals), Pen/Strep al 1% (Gibco) y 1 % Anfotericina B (Gibco) a 37 °C con 5% CO2. Vero E6-TMPRSS2-T2A-ACE2 se obtuvieron de BEI Resources (NR-54970, RRID: CVCL_C7NK) y se cultivaron en DMEM (Corning) que contenía L-glutamina 4 mM, 4500 mg por L de glucosa, piruvato de sodio 1 mM y 1500 mg por L. L bicarbonato de sodio, suplementado con 10% de suero fetal bovino y 10 μg por ml de puromicina (Sigma) a 37 °C con 5% de CO2. Se confirmó que ambas líneas celulares estaban libres de micoplasmas a su llegada y a intervalos mensuales.

Se mantuvieron y criaron ratones C57BL/6 J y K18-hACE2 C57BL/6 J (cepa 2B6.Cg-Tg(K18-ACE2)2Prlmn/J) (Jackson Laboratories, ME) en una instalación animal convencional. Para producir ratones neonatales heterocigotos K18-hACE2 C57BL/6 J para los experimentos de transmisión, se cruzaron hembras C57BL/6 J con machos homocigotos K18-hACE2 C57BL/6 J. Los cachorros fueron alojados con su madre durante todos los experimentos. En todos los experimentos se utilizaron animales experimentales de ambos sexos y se agruparon para el análisis. Los experimentos con animales se realizaron en las instalaciones de Nivel de Bioseguridad Animal 3 (ABSL3) de la Facultad de Medicina Grossman de la Universidad de Nueva York (Nueva York, NY), de acuerdo con su Manual de Bioseguridad y sus Procedimientos Operativos Estándar. El estudio recibió la aprobación ética del Comité de Uso y Cuidado de Animales de la Facultad de Medicina Grossman de la Universidad de Nueva York (IACUC) según el protocolo IACUC n.º IA18-00071 (Dittmann).

Todo el trabajo con aislados infecciosos de SARS-CoV-2 y virus recombinantes, incluido el trabajo con animales infectados, se realizó en las instalaciones de Nivel 3 de Bioseguridad Animal (ABSL3) de la Universidad de Maryland (Baltimore, MD) y la Facultad de Medicina Grossman de la Universidad de Nueva York (Nueva York). York, Nueva York). Ambas instalaciones están registradas en sus respectivos Departamentos de Salud locales y pasaron las inspecciones de los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC (Centros para el Control de Enfermedades)) dentro del año de presentación de este manuscrito. Las instalaciones ABSL3 se operan de acuerdo con sus manuales de bioseguridad y procedimientos operativos estándar, incluso para la contención de aerosoles biopeligrosos utilizando gabinetes de bioseguridad certificados y los sistemas de ventilación sellados de las instalaciones que brindan un flujo de aire direccional sostenido, desde áreas limpias hacia áreas potencialmente contaminadas, y HEPA- escape filtrado. Los desechos biopeligrosos generados en las instalaciones se descontaminan completamente utilizando desinfectantes aprobados, seguido de esterilización en autoclave e incineración como desechos médicos regulados. El acceso a las instalaciones ABSL3 está restringido al personal certificado y autorizado, inscrito en programas de vigilancia de salud ocupacional y que use equipo de protección personal (EPP) adecuado, incluidos respiradores aprobados por OSHA, protección para los ojos, overoles resistentes a derrames y guantes dobles. Cuando se analizaron fuera de las instalaciones de ABSL3, las muestras infecciosas se trataron minuciosamente utilizando métodos de inactivación examinados.

Todo el trabajo con aislados infecciosos de SARS-CoV-2 y virus recombinantes se realizó con la aprobación previa de los Comités Institucionales de Bioseguridad (IBC) de la Facultad de Medicina de la Universidad de Maryland y la Facultad de Medicina Grossman de la Universidad de Nueva York. Los CDC aprobaron los permisos de importación para los aislados de la variante del SARS-CoV-2. El IBC (Comité Institucional de Bioseguridad) de la Facultad de Medicina de la Universidad de Maryland aprobó la generación de virus recombinantes del SARS-CoV-2 para la MF.

Los siguientes reactivos se obtuvieron a través de BEI Resources, NIAID, NIH (Institutos Nacionales de Salud): SARS-Related Coronavirus 2, Isolate USA-WA1/2020, NR-52281, depositado por los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades; Coronavirus 2 relacionado con el SARS, aislado hCoV-19/England/204820464/2020, B.1.1.7, NR-54000, aportado por Bassam Hallis; Coronavirus 2 relacionado con el SARS, aislado hCoV-19/Sudáfrica/KRISP-EC-K005321/2020 (NR-54008), aportado por Alex Sigal y Tulio de Oliveira; Coronavirus 2 relacionado con el SARS, aislado hCoV-19/Japón/TY7-503/2021 (Brasil P.1), NR-54982, aportado por el Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas, variante Delta del SARS-CoV-2, aislado hCoV19/EE.UU./ PHC658/2021, B.1.617.2, NR-55611. SARS-CoV-2 Omicron BA.1 (hCoV-19/USA/GA-EHC-2811C/2021, EPI_ISL_7171744) fueron amablemente proporcionados por el Laboratorio Suthar de la Universidad Emory. SARS-CoV-2 hCoV-19/USA/CA-Stanford-106_S04/2022 (Omicron BQ1.1, EPI_ISL_15196219) se obtuvo del Dr. Mehul Suthar (Universidad Emory, Atlanta, Georgia, EE. UU.) y del Dr. Benjamin Pinsky (Stanford Universidad, Stanford, California, EE.UU.). El stock USA-WA1/2020 se produjo como se describió anteriormente80. Los otros virus SARS-CoV-2 se pasaron una vez en células Vero E6 suplementadas con 1 µg/ml de l-1-tosilamido-2-feniletil clorometilcetona (TPCK)-tripsina, para evitar la adaptación del virus a las células Vero E6 debido a la falta de expresión de TMPRSS2. Las células se infectaron con una MOI de 0,01 y se recogieron con un efecto citopático (CPE) del 50 %. Después de la cosecha, el virus se purificó utilizando un cojín de sacarosa al 25% a 25.000 RPM durante 3 a 4 h y se resuspendió usando PBS (solución salina tamponada con fosfato) antes de la infección. Para las reservas B.1.1.7, B.1.1.351 y P.1, las alícuotas se purificaron inicialmente en placa y se secuenciaron para verificar la firma de la variante antes de expandirse en presencia de TPCK-tripsina para generar una reserva de trabajo del paso 1. Realizamos un paso de exclusión de desechos celulares mediante centrifugación de mesa antes de continuar con el paso de granulación del virus a través de un cojín de sacarosa. Luego resuspendemos el sedimento en un volumen bajo, lo que da como resultado reservas de SARS-CoV-2 purificadas y altamente concentradas. WA-1 ΔORF6, WA-1ΔORF8 y su control WA-1 se generaron en el Laboratorio Frieman de la Facultad de Medicina de la Universidad de Maryland61; Se utilizaron alícuotas según lo previsto para los experimentos. Para el SARS-CoV-2 WA-1 inactivado por calor (HI), las reservas virales se incubaron a 56 °C durante 5 h. Las muestras se titularon para confirmar la inactivación completa de partículas infecciosas.

Los cachorros infectados como se describe anteriormente fueron sacrificados de acuerdo con un procedimiento humano aprobado por IACUC a 2 ppp. La piel de las cabezas se eliminó suavemente para preservar las estructuras nasales. Luego se retiraron las cabezas y se sumergieron en PBS a 4 °C para un breve lavado, seguido de fijación en paraformaldehído al 4% durante 72 h a 4 °C sin agitación. Luego se lavaron las cabezas en PBS a 4 °C con agitación suave durante 20 minutos, seguido de descalcificación en una solución de EDTA 0,12 M a 4 °C con agitación suave durante 7 días. Luego, las cabezas intactas se procesaron a través de etanoles graduados hasta xileno y se infiltraron con parafina en un procesador de tejidos automatizado Leica Peloris. Las secciones incluidas en parafina se inmunotiñeron en un Leica BondRX, según las instrucciones del fabricante. En resumen, las secciones desparafinadas se sometieron a una recuperación de calor de 20 minutos en tampón Leica ER2 (pH9, AR9640) seguida de Rodent Block (Biocare, RBM961 L) antes de una incubación de 1 h con el anticuerpo de la proteína N del SARS-CoV-2 (clon 1C7C7, Cell Signaling Technology, Cat #68344) en una dilución de 1:300 y un secundario de cabra-anti-ratón conjugado con AF594 (ThermoFisher, Cat # A11005) a 1:100. Los portaobjetos se tiñeron con DAPI. La adquisición de imágenes semiautomática se realizó en un sistema de imágenes multiespectrales Vectra® Polaris. Después de escanear todo el portaobjetos a 20X, el tejido se delineó manualmente para seleccionar campos para la separación espectral y el análisis de imágenes utilizando el software InForm® versión 2.6 de Akoya Biosciences. Los datos de las imágenes de investigación se gestionaron utilizando OMERO Plus v5.6 (software Glencoe) para visualización, anotación y/o creación de figuras con OMERO.figure v 4.4 (equipo OME).

Se infectaron ratones hemicigotos adultos C57BL/6 J K18-hACE2+/- (13 semanas de edad, ambos sexos) con una dosis letal (10 000 UFP) del SARS-CoV-2 ancestral USA_WA-1/2020 mediante una infección intranasal de 10 μL en Anestesia con ketamina/xilazina. Los ratones machos y hembras se alojaron por separado en grupos de cuatro con un índice de infectados y una proporción de contactos no infectados de 1:3. La eliminación del virus se recogió sumergiendo las fosas nasales de cada ratón tres veces en medio viral (PBS más albúmina sérica bovina [BSA] al 0,3%) diariamente durante 10 días. La transmisión dentro de la jaula se determinó mediante la presencia de partículas infecciosas en ratones en contacto. El % de adquisición se calificó y presentó como se describe a continuación. Los moribundos fueron sacrificados mediante asfixia con CO2 seguida de dislocación cervical cuando se cumplieron los criterios humanitarios. A los 10 ppp, los animales supervivientes fueron sacrificados mediante asfixia con CO2 seguida de punción cardíaca. Se realizaron lavados retrotraqueales de las vías respiratorias superiores de los animales supervivientes empujando 500 µl de PBS estéril a través de la tráquea y fuera de las fosas nasales. Los pulmones se recogieron y homogeneizaron con perlas de acero inoxidable como se describe a continuación.

Para evaluar la seroconversión debida a la transmisión, se infectaron ratones adultos (de 13 semanas de edad) como se describió anteriormente y se alojaron por separado en grupos de índice infectado 1:3 y 1:2: contactos no infectados. Se inocularon ratones macho de 13 semanas de edad con 10 μl de PBS estéril y se inocularon ratones hembra de 12 semanas con una dosis subletal de 10 μl de SARS-CoV-2 USA_WA-1/2020 (1000 UFP). Los ratones fueron monitoreados diariamente para determinar su peso y supervivencia. Tres semanas después de la infección, los animales fueron sacrificados mediante asfixia con CO2 seguida de punción cardíaca. Se recogieron lavados retrotraqueales de la URT y homogeneizados de pulmón como se describe anteriormente. La sangre se recogió mediante punción cardíaca utilizando una jeringa de insulina 28G1/2 de 1 ml y se añadió a un tubo de recogida de suero (BD Microtainer 365967). Los tubos se incubaron durante 45 minutos a temperatura ambiente para facilitar la coagulación de la sangre y luego se centrifugaron a 4 °C durante 10 minutos (1500 x g). El suero se separó, se congeló a –80 °C y se analizó la presencia de anticuerpos IgG contra Spike Trimer (Acro Biosystems RAS-T023).

Los ratones neonatales se consideraron ratones de 4 a 7 días de edad. No se determinó el sexo de las crías individuales y, por lo tanto, es probable que se utilizaran animales de ambos sexos en todos los experimentos con ratones neonatales. Los cachorros se infectaron con un inóculo de PBS estéril de 3 μL sin anestesia general (para evitar la inoculación pulmonar directa) mediante instilación intranasal de 1500 UFP de SARS-CoV-2 WA-1, variante de SARS-CoV-2 o SARS-CoV-2 recombinante y regresó a la presa de lactancia durante la duración del experimento. En los experimentos de transmisión, uno o dos cachorros, como se indica en la leyenda de la figura, fueron infectados y devueltos a sus compañeros de camada (no infectados) durante la duración del experimento. La eliminación del virus se recogió sumergiendo las fosas nasales de cada ratón tres veces en medio viral (PBS más albúmina sérica bovina [BSA] al 0,3 %) diariamente, y las muestras se evaluaron mediante PCR cuantitativa de transcripción inversa (RT-qPCR) o ensayo de placa. La transmisión dentro de la camada se evaluó mediante la recolección diaria de muestras de excreción en los compañeros de camada (contacto). El % de adquisición se visualizó en gráficos de Kaplan-Meier invertidos. Los eventos de adquisición se calificaron como al menos dos días de título viral infeccioso en las muestras de diseminación. El inicio de la adquisición se calificó como el primer día de detección del virus infeccioso. Los cachorros y la madre fueron sacrificados mediante asfixia con CO2 seguida de punción cardíaca. El tracto respiratorio superior (URT) se sometió a un lavado retrotraqueal (lavado de 300 μl de PBS de la tráquea y recolección a través de las fosas nasales) y se usaron muestras para cuantificar los virus (mediante ensayo de placa o qRT-PCR). Las proporciones de índice para contactar a los cachorros oscilaron entre 1:6-9 para la comparación de variantes y 1:3-1:4 para la optimización del modelo con WA-1.

Las extracciones de ARN se realizaron utilizando el kit Qiagen QIAamp Viral RNA. El número de copias virales de N por µl se cuantificó mediante RT-qPCR utilizando el kit de RT-PCR de un solo paso Taqman® RNA-to-CT (Applied BiosystemsTM) con cebadores y sonda de SARS-CoV-2 dirigidos a un amplicón en el N. proteína del SARS-CoV-2 WA-1 (Adelante: 5'ATGCTGCAATCGTGCTACAA3'; reverso: 5' GACTGCCCGCCTCTGCTC3') y la sonda 5'/56-FAM/TCAAGGAAC/ZEN/AACATTGCCAA/3IABkFQ/3'. Se generó una curva estándar para cada conjunto de datos utilizando la secuencia de ARN del SARS-CoV-2 N transcrita in vitro (MN985325.1).

Los títulos virales infecciosos se determinaron mediante ensayo de placa. En resumen, se agregaron diluciones de 10 veces de cada virus en DMEM + 1% de antibiótico/antimicótico (Gibco) a una monocapa de células Vero E6-TMPRSS2-T2A-ACE2 durante 1 h a 37 °C. Después de la incubación, las células se cubrieron con agarosa al 0,8% en DMEM que contenía FBS al 2% y se incubaron a 37 °C durante 36 horas. Las células se fijaron con formalina al 10%, se retiró el tapón de agarosa y las placas se visualizaron mediante tinción con violeta cristal. Las reservas y muestras obtenidas de experimentos con ratones (desprendimiento, lavado y homogeneizados de pulmón) se titularon en Vero E6-TMPRSS2-T2A-ACE2.

Los pulmones se recogieron en 500 µl de DPBS que contenía una perla de acero inoxidable (QIAGEN), se homogeneizaron con Tissue-Lyser II (QIAGEN) y los desechos se bajaron a 8000 rpm durante 8 minutos. Los títulos virales se determinaron mediante ensayo de placa utilizando células Vero E6-TMPRSS2-T2A-ACE2.

Los niveles de citocinas y quimiocinas se midieron en suero de ratón utilizando el ensayo Bio-Plex Pro Mouse Cytokine 23-plex (Bio-Rad). Las citocinas y quimiocinas se registraron en una máquina MAGPIX (Luminex) y se cuantificaron mediante comparación con una curva estándar. Para la recolección y análisis de datos se utilizó el software xPONENT versión 4.3.229.0. Utilizamos los límites de detección obtenidos experimentalmente para cada proteína y establecimos valores por debajo de ese límite de detección en un log por debajo del límite. Todas las muestras se normalizaron con respecto a las de animales tratados con PBS. Los mapas de calor agrupados se generaron utilizando el paquete ComplexHeatmap v.2.14.0.

Todos los análisis estadísticos se realizaron con GraphPad Prism 9.5. Cada experimento se completó al menos dos veces independientes con duplicados biológicos internos a menos que se indique lo contrario en las leyendas de las figuras. Los datos se representan como la media geométrica ± desviación estándar geométrica (DE). Se realizaron pruebas de Kruskal-Wallis y de Mantel-Cox de rango logarítmico, que se indican específicamente en las leyendas de las figuras. En las figuras solo se mostraron valores de p < 0,05 y los valores de p > 0,05 se consideraron no significativos (ns).

El número exacto de réplicas biológicas (n) es el siguiente:

Figura 1

b índice n = 4, contacto n = 9

c índice n = 4, contacto n = 9

índice d n = 4, contacto n = 9

e índice n = 4, contacto n = 9

fn = 1 ratón

Figura 2

bn = 8 para desprendimiento longitudinal, n = 7 para muestreo del día 2

cn = 15 para desprendimiento longitudinal, n = 13 para muestreo del día 2

dn = 7 para desprendimiento longitudinal, n = 5 para muestreo del día 2

en = 8 para desprendimiento longitudinal, n = 6 para muestreo del día 2

fn = 7 para desprendimiento longitudinal, n = 5 para muestreo del día 2

gn = 12 para desprendimiento longitudinal, n = 5 para muestreo del día 2

hn = 1 ratón por variante del SARS-CoV-2

figura 3

an = 12 para desprendimiento longitudinal, n = 12 para parcelas de Kaplan-Meier

bn = 27 para desprendimiento longitudinal, n = 27 para parcelas de Kaplan-Meier

cn = 14 para desprendimiento longitudinal, n = 14 para parcelas de Kaplan-Meier

dn = 15 para desprendimiento longitudinal, n = 15 para parcelas de Kaplan-Meier

en = 13 para desprendimiento longitudinal, n = 13 para parcelas de Kaplan-Meier

fn = 8 para desprendimiento longitudinal, n = 8 para parcelas de Kaplan-Meier

gn = 12 para desprendimiento longitudinal, n = 12 para parcelas de Kaplan-Meier

Figura 4

an = 7 para desprendimiento longitudinal, n = 5 muestreo del día 2

bn = 8 para desprendimiento longitudinal, n = 6 muestreo del día 2

cn = 10 para desprendimiento longitudinal, n = 8 muestreo del día 2

dn = 12 para desprendimiento longitudinal, n = 12 para parcelas de Kaplan-Meier

en = 14 para desprendimiento longitudinal, n = 14 muestreo del día 2

fn = 13 para desprendimiento longitudinal, n = 13 muestreo del día 2

gn = 19 para muestras de URT individuales (PBS n = 6, r-WA-1 n = 4, ORF6 n = 5, ORF8 n = 4), n = 21 para muestras de pulmones individuales (PBS n = 6, r-WA- 1 norte = 5, ORF6 norte = 5, ORF8 norte = 5)

hn = 1 ratón por variante del SARS-CoV-2

Figura complementaria 1

b peso: índice n = 3 (m = 2, f = 1), contacto n = 9 (m = 6, f = 3)

c curva de supervivencia: índice n = 3 (m = 2, f = 1), contacto n = 9 (m = 6, f = 3)

d desprendimiento longitudinal: índice n = 3 (m = 2, f = 1), contacto n = 9 (m = 6, f = 3)

e títulos pulmonares de criterio de valoración: contacto n = 9 (m = 6, f = 3)

f seroconversión (control y contacto): n = 11 (PBS n = 3 (m = 3), subletal n = 3 (f = 3), contactos n = 5 (m = 2, f = 3))

peso h: n = 12 (1500 UFP n = 6, 15000 UFP n = 3, 50000 UFP n = 3)

i eventos de mortalidad: n = 21 (1500 UFP n = 9, 15000 UFP n = 9, 50000 UFP n = 3)

j títulos longitudinales: n = 12 (1500 UFP n = 3, 15000 UFP n = 3, 50000 UFP n = 3)

k desprendimiento longitudinal: n = 11

Figura complementaria 2:

títulos de un compartimento longitudinal: día 1: n = 5, día 2: n = 7, día 3: n = 4

b títulos del compartimento longitudinal: día 1: n = 11, día 2: n = 13

títulos del compartimento c: día 1: n = 6

d títulos de desprendimiento longitudinal: n = 11

e títulos del compartimento longitudinal: día 1: n = 5

fn = 1 ratón

Figura complementaria 3:

an = 12 para contactos, n = 2 para índice

bn = 27 para desprendimiento longitudinal, n = 4 para índice

cn = 14 para desprendimiento longitudinal, n = 2 para índice

dn = 15 para desprendimiento longitudinal, n = 2 para índice

en = 13 para desprendimiento longitudinal, n = 2 para índice

fn = 8 para desprendimiento longitudinal, n = 2 para índice

gn = 12 para desprendimiento longitudinal, n = 2 para índice

Figura complementaria 4:

an = 19 para muestras de URT individuales (PBS n = 6, r-WA-1 n = 4, ORF6 n = 5, ORF8 n = 4), bn = 21 para muestras de pulmones individuales (PBS n = 6, r-WA- 1 norte = 5, ORF6 norte = 5, ORF8 norte = 5)

Figura complementaria 5:

a r-WA-1 peso longitudinal: índice n = 4, contacto n = 16, supervivencia longitudinal (muertes): índice: n = 3, contacto n = 14

b Peso longitudinal ORF6: índice n = 2, contacto n = 14, supervivencia longitudinal (muertes): índice: n = 2, contacto n = 7

c Peso longitudinal ORF8: índice n = 2, contacto n = 13, supervivencia longitudinal (muertes): índice: n = 2, contacto n = 6

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Todos los datos generados en este estudio se proporcionan en el archivo de información complementaria/datos fuente. Los datos originales se proporcionan con este documento.

https://covariants.org.

Kyriakidis, N. C., Lopez-Cortes, A., Gonzalez, E. V., Grimaldos, A. B. & Prado, E. O. SARS-CoV-2 vaccines strategies: a comprehensive review of phase 3 candidates. NPJ Vaccines 6, 28 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhou, P. y col. Un brote de neumonía asociado a un nuevo coronavirus de probable origen en murciélagos. Naturaleza 579, 270–273 (2020).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hu, B., Guo, H., Zhou, P. y Shi, ZL Características del SARS-CoV-2 y el COVID-19. Nat Rev Microbiol 19, 141-154 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Minkoff, JM y tenOever, B. Estrategias de evasión inmune innata del SARS-CoV-2. Nat Rev Microbiol 21, 178–194 (2023).

CAS PubMed PubMed Central Google Académico

Xia, H. y col. Evasión del Interferón tipo I por el SARS-CoV-2. Representante celular 33, 108234 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kopecky-Bromberg, SA, Martinez-Sobrido, L., Frieman, M., Baric, RA y Palese, P. El marco de lectura abierto (ORF) 3b, ORF 6 y las proteínas de la nucleocápside del coronavirus del síndrome respiratorio agudo severo funcionan como antagonistas del interferón. J Virol 81, 548–557 (2007).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Konno, Y. et al. SARS-CoV-2 ORF3b es un potente antagonista del interferón cuya actividad aumenta mediante una variante de elongación natural. Representante celular 32, 108185 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Schroeder, S. y col. Antagonismo del interferón por el SARS-CoV-2: un estudio funcional mediante genética inversa. Lancet Microbe 2, e210 – e218 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Shemesh, M. y col. El SARS-CoV-2 suprime la producción de IFNbeta mediada por NSP1, 5, 6, 15, ORF6 y ORF7b, pero no suprime los efectos del interferón añadido. PLoS Pathog 17, e1009800 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Callaway, E. Qué significan las variantes BA.4 y BA.5 de Omicron para la pandemia. Naturaleza 606, 848–849 (2022).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Lamers, MM y Haagmans, BL Patogénesis del SARS-CoV-2. Nat Rev Microbiol 20, 270–284 (2022).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Liu, Z. y col. El análisis del panorama de las variantes de escape identifica mutaciones de picos del SARS-CoV-2 que atenúan la neutralización de anticuerpos monoclonales y séricos. bioRxiv (2021). https://doi.org/10.1101/2020.11.06.372037.

Richard, M. y otros. El SARS-CoV-2 se transmite por contacto y por el aire entre hurones. Nat Comuna 11, 3496 (2020).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sia, SF y cols. Patogenia y transmisión del SARS-CoV-2 en hámsteres dorados. Naturaleza 583, 834–838 (2020).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Imai, M. y col. Los hámsteres sirios como modelo animal pequeño para la infección por SARS-CoV-2 y el desarrollo de contramedidas. Proc Natl Acad Sci USA 117, 16587–16595 (2020).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ortigoza, MB, Blaser, SB, Zafar, MA, Hammond, AJ y Weiser, JN Un modelo de ratón infantil de transmisión del virus de la influenza demuestra el papel de la diseminación específica del virus, la inmunidad humoral y la expresión de sialidasa mediante la colonización de Streptococcus pneumoniae. mBio 9 (2018). https://doi.org/10.1128/mBio.02359-18.

Rodewald, AK, Onderdonk, AB, Warren, HB y Kasper, DL Modelo de ratón neonatal de infección por estreptococos del grupo B. J Infect Dis 166, 635–639 (1992).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Abruzzo, AR, Aggarwal, SD, Sharp, ME, Bee, GCW y Weiser, JN Efectos dependientes del serotipo sobre la dinámica de la colonización neumocócica e implicaciones para la transmisión. mBio 13, e0015822 (2022).

Artículo PubMed Google Scholar

Zafar, MA y cols. La identificación de los factores neumocócicos que afectan la diseminación neumocócica muestra que el locus dlt promueve la inflamación y la transmisión. mBio 10 (2019).https://doi.org/10.1128/mBio.01032-19.

Zafar, MA, Kono, M., Wang, Y., Zangari, T. y Weiser, JN Modelo de ratón infantil para el estudio de la diseminación y transmisión durante la monoinfección por Streptococcus pneumoniae. Infectar Immun 84, 2714–2722 (2016).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zangari, T., Ortigoza, MB, Lokken-Toyli, KL y Weiser, JN La señalización del interferón tipo I es un factor común que impulsa la diseminación y transmisión del virus de la influenza A y el Streptococcus pneumoniae. mBio 12 (2021). https://doi.org/10.1128/mBio.03589-20.

Compton, SR, Paturzo, FX y Macy, JD Transmisión de parvovirus de ratón a ratones neonatales. J Am Assoc Lab Anim Sci 51, 797–802 (2012).

CAS PubMed PubMed Central Google Académico

Han, P. y col. Unión del receptor y estructuras complejas de ACE2 humano para aumentar el RBD de omicron y delta SARS-CoV-2. Celda 185, 630–640.e610 (2022).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Huang, H., Zhu, Y., Niu, Z., Zhou, L. y Sun, Q. Variantes preocupantes del SARS-CoV-2 N501Y y su posible transmisión por ratón. La muerte celular difiere 28, 2840–2842 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

McCray, PB Jr. y col. Infección letal de ratones K18-hACE2 infectados con coronavirus del síndrome respiratorio agudo severo. J Virol 81, 813–821 (2007).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Pan, T. y col. La infección de ratones de tipo salvaje por la variante B.1.351 del SARS-CoV-2 indica una posible nueva ruta de transmisión entre especies. Objetivo de transducción de señales Ther 6, 420 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lowen, AC, Mubareka, S., Tumpey, TM, García-Sastre, A. y Palese, P. El conejillo de indias como modelo de transmisión de virus de influenza humana. Proc Natl Acad Sci USA 103, 9988–9992 (2006).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Edenborough, KM, Gilbertson, BP y Brown, LE Un modelo de ratón para el estudio de la transmisión dependiente del contacto del virus de la influenza A y los factores que gobiernan la transmisibilidad. J Virol 86, 12544–12551 (2012).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rosenke, K. y col. La variante UK B.1.1.7 (Alfa) muestra una mayor replicación respiratoria y eliminación en primates no humanos. Los microbios emergentes infectan 10, 2173–2182 (2021).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

von Wintersdorff, CJH et al. Las infecciones con la variante Delta del SARS-CoV-2 exhiben cargas virales cuatro veces mayores en las vías respiratorias superiores en comparación con las variantes Alfa o no preocupantes. Informe científico 12, 13922 (2022).

ADS del artículo Google Scholar

Yan, J. y col. Virus infeccioso en el aliento exhalado de casos sintomáticos de influenza estacional de una comunidad universitaria. Proc Natl Acad Sci USA 115, 1081–1086 (2018).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Danzy, S., Lowen, AC & Steel, J. Un enfoque cuantitativo para evaluar la aptitud y transmisión del virus de la influenza A en conejillos de indias. J Virol 95 (2021). https://doi.org/10.1128/JVI.02320-20.

Mubareka, S. y col. Transmisión del virus de la influenza a través de aerosoles y fómites en el modelo de cobaya. J Infect Dis 199, 858–865 (2009).

Artículo PubMed Google Scholar

Puerto, JR et al. Determinantes virales y del huésped de la transmisión aérea del SARS-CoV-2 en el hámster sirio. bioRxiv (2023). https://doi.org/10.1101/2022.08.15.504010.

Yuan, S. y col. Patogenicidad, transmisibilidad y aptitud del SARS-CoV-2 Omicron en hámsteres sirios. Ciencia 377, 428–433 (2022).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Halfmann, PJ y cols. El virus SARS-CoV-2 Omicron causa enfermedad atenuada en ratones y hámsteres. Naturaleza 603, 687–692 (2022).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Boon, ACM y cols. Reducción de la transmisión aérea del virus SARS-CoV-2 BA.1 Omicron en hámsteres sirios. PLoS Pathog 18, e1010970 (2022).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Leung, NHL Transmisibilidad y transmisión de virus respiratorios. Nat Rev Microbiol 19, 528–545 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Silvas, JA et al. Contribución de las proteínas accesorias del SARS-CoV-2 a la patogenicidad viral en ratones transgénicos ACE2 humanos K18. J Virol 95, e0040221 (2021).

Artículo PubMed Google Scholar

Liu, Y. et al. Una vacuna candidata viva atenuada contra el SARS-CoV-2 con deleciones de proteínas accesorias. Nat Comuna 13, 4337 (2022).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kehrer, T. y col. Impacto del SARS-CoV-2 ORF6 y sus polimorfismos variantes en las respuestas del huésped y la patogénesis viral. bioRxiv (2022). https://doi.org/10.1101/2022.10.18.512708.

Li, JY y cols. Las proteínas ORF6, ORF8 y la nucleocápside del SARS-CoV-2 inhiben la vía de señalización del interferón tipo I. Investigación de virus 286, 198074 (2020).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Miorin, L. et al. SARS-CoV-2 Orf6 secuestra Nup98 para bloquear la importación nuclear STAT y antagonizar la señalización del interferón. Proc Natl Acad Sci USA 117, 28344–28354 (2020).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

McGrath, ME y cols. El pico de variante del SARS-CoV-2 y las mutaciones de genes accesorios alteran la patogénesis. Proc Natl Acad Sci USA 119, e2204717119 (2022).

Artículo MathSciNet CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bayarri-Olmos, R. et al. La variante alfa/B.1.1.7 SARS-CoV-2 exhibe una afinidad significativamente mayor por ACE-2 y requiere dosis de inoculación más bajas para causar enfermedad en ratones K18-hACE2. Elife 10 (2021). https://doi.org/10.7554/eLife.70002.

Shuai, H. y col. Replicación atenuada y patogenicidad del SARS-CoV-2 B.1.1.529 Omicron. Naturaleza 603, 693–699 (2022).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Horspool, AM y cols. Las variantes preocupantes del SARS-CoV-2 B.1.1.7 y B.1.351 inducen una enfermedad letal en ratones transgénicos K18-hACE2 a pesar de la terapia con plasma convaleciente. bioRxiv (2021). https://doi.org/10.1101/2021.05.05.442784.

Winkler, ES et al. El SARS-CoV-2 causa infección pulmonar sin enfermedad grave en ratones humanos con ACE2 Knock-In. J Virol 96, e0151121 (2022).

Artículo PubMed Google Scholar

Winkler, ES et al. La infección por SARS-CoV-2 de ratones transgénicos ACE2 humanos causa inflamación pulmonar grave y deterioro de la función. Nat Immunol 21, 1327-1335 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhang, Y. et al. El SARS-CoV-2 se adapta rápidamente en ratones BALB/c de edad avanzada e induce una neumonía típica. J Virol 95 (2021). https://doi.org/10.1128/JVI.02477-20.

Yasui, F. et al. La infección con la variante B.1.351 del SARS-CoV-2 es letal en ratones BALB/c de edad avanzada. Representante científico 12, 4150 (2022).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ribaric, NL, Vincent, C., Jonitz, G., Hellinger, A. y Ribaric, G. Peligros ocultos de la transmisión del SARS-CoV-2 en hospitales: una revisión sistemática. Aire interior 32, e12968 (2022).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Cowling, BJ y cols. La transmisión por aerosoles es una forma importante de propagación del virus de la influenza A. Nat Comuna 4, 1935 (2013).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Duval, D. y col. Transmisión aérea a larga distancia del SARS-CoV-2: revisión sistemática rápida. BMJ 377, e068743 (2022).

Artículo PubMed Google Scholar

Ganti, K. y col. El momento de la exposición es fundamental en un modelo altamente sensible de transmisión del SARS-CoV-2. PLoS Pathog 18, e1010181 (2022).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Moon, J. & Ryu, BH Riesgos de transmisión de enfermedades infecciosas respiratorias en diversos espacios confinados: un metanálisis para futuras pandemias. Entorno Res 202, 111679 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Poon, LL y cols. Variaciones de la secuencia genética viral en los virus de la influenza pandémica H1N1/2009 y estacional H3N2 dentro de un individuo, un hogar y una comunidad. Revista de virología clínica: publicación oficial de la Sociedad Panamericana de Virología Clínica 52, 146–150 (2011).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Madewell, ZJ, Yang, Y., Longini, IM Jr., Halloran, ME y Dean, NE Transmisión doméstica del SARS-CoV-2: una revisión sistemática y un metanálisis. JAMA Netw Open 3, e2031756 (2020).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Baker, JM y cols. Transmisión de la variante SARS-CoV-2 B.1.1.529 (Omicron) dentro de los hogares: cuatro jurisdicciones de EE. UU., noviembre de 2021 a febrero de 2022. MMWR Morb Mortal Wkly Rep 71, 341–346 (2022).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Puhach, O., Meyer, B. y Eckerle, I. Carga viral del SARS-CoV-2 y cinética de eliminación. Nat Rev Microbiol 21, 147–161 (2023).

CAS PubMed Google Académico

Cevik, M. y col. Dinámica de la carga viral de SARS-CoV-2, SARS-CoV y MERS-CoV, duración de la diseminación viral e infecciosidad: una revisión sistemática y un metanálisis. Lancet Microbe 2, e13 – e22 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Puerto, JR et al. La gravedad de la enfermedad SARS-CoV-2 y la eficiencia de transmisión aumentan en los hámsteres sirios en comparación con la exposición a fómites. Nat Comuna 12, 4985 (2021).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Qu, P. et al. Evasión de respuestas de anticuerpos neutralizantes por la variante SARS-CoV-2 BA.2.75. Microbio huésped celular 30, 1518–1526 e1514 (2022).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wibmer, CK y cols. El SARS-CoV-2 501Y.V2 escapa a la neutralización por el plasma de un donante sudafricano de COVID-19. Medicina natural 27, 622–625 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Planas, D. et al. Escape considerable del Omicron del SARS-CoV-2 hacia la neutralización de anticuerpos. Naturaleza 602, 671–675 (2022).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Bruel, T. y col. Análisis longitudinal de la neutralización sérica de SARS-CoV-2 Omicron BA.2, BA.4 y BA.5 en pacientes que reciben anticuerpos monoclonales. Cell Rep Med 3, 100850 (2022).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Planas, D. et al. Sensibilidad reducida de la variante Delta del SARS-CoV-2 a la neutralización de anticuerpos. Naturaleza 596, 276–280 (2021).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Bruel, T. y col. Neutralización sérica de los sublinajes BA.1 y BA.2 de Omicron del SARS-CoV-2 en pacientes que reciben anticuerpos monoclonales. Medicina de la naturaleza 28, 1297–1302 (2022).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Hoffmann, M. y col. La variante Omicron es altamente resistente a la neutralización mediada por anticuerpos: implicaciones para el control de la pandemia de COVID-19. Celda 185, 447–456.e411 (2022).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Matsuoka, K. y col. La proteína accesoria ORF8 del SARS-CoV-2 se secreta extracelularmente como un homodímero de glicoproteína. J Biol Chem 298, 101724 (2022).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lin, X. y col. La secreción no convencional de ORF8 no glicosilado es fundamental para la tormenta de citocinas durante la infección por SARS-CoV-2. PLoS Pathog 19, e1011128 (2023).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lin, X. y col. ORF8 contribuye a la tormenta de citoquinas durante la infección por SARS-CoV-2 al activar la vía IL-17. iCiencia 24, 102293 (2021).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wu, X. y col. Mimetismo viral de la interleucina-17A por el ORF8 del SARS-CoV-2. mBio 13, e0040222 (2022).

Artículo PubMed Google Scholar

Kee, J. y col. El SARS-CoV-2 altera la regulación epigenética del huésped mediante el mimetismo de histonas. Naturaleza 610, 381–388 (2022).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhang, Y. et al. La proteína ORF8 del SARS-CoV-2 media la evasión inmunitaria mediante la regulación negativa del MHC-Iota. Proc Natl Acad Sci USA 118 (2021). https://doi.org/10.1073/pnas.2024202118.

Selvaraj, C. y col. Análisis del modo de unión y dimerización de ORF8 del SARS-CoV-2 con MHC de clase I: enfoques computacionales para identificar inhibidores de COVID-19. Genómica de funciones breves (2023). https://doi.org/10.1093/bfgp/elac046.

Pereira, F. Dinámica evolutiva del gen accesorio ORF8 del SARS-CoV-2. Infect Genet Evol 85, 104525 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

DeRonde, S., Deuling, H., Parker, J. y Chen, J. Identificación de una nueva variante del SARS-CoV-2 con una proteína truncada en el gen ORF8 mediante secuenciación de próxima generación. Informe científico 12, 4631 (2022).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

de Vries, M. et al. Un análisis comparativo de los antivirales del SARS-CoV-2 caracteriza al inhibidor 3CL(pro) PF-00835231 como un posible nuevo tratamiento para la COVID-19. J Virol 95 (2021). https://doi.org/10.1128/JVI.01819-20.

Descargar referencias

Agradecemos a Thomas M. Moran, Escuela de Medicina Icahn en Mount Sinai, y Luis Martínez-Sobrido, Instituto Biomédico de Texas, por el amable obsequio del anticuerpo monoclonal de ratón SARS-CoV N 1C7, y a Mehul Suthar, Escuela de Medicina Emory, y Benjamin Pinsky, Universidad de Stanford, por el regalo de las variantes. Agradecemos a Ashley Fisher y Nicole Rondeau por su ayuda en la compilación del archivo de datos fuente. Agradecemos al Programa de Evaluación de la Evolución Viral (SAVE) del SARS-CoV-2 por sus aportes críticos sobre nuestros datos. La histopatología de la nasofaringe murina fue realizada por Mark Alu y Branka Brukner Dabovic del Laboratorio de Investigación de Patología Experimental de NYUMC (RRID: SCR_017928). Tanto el Laboratorio de Investigación de Patología Experimental como el Núcleo de Tecnología del Genoma de la Universidad de Nueva York cuentan con el respaldo de la subvención de apoyo P30CA016087 del Centro Oncológico de la Universidad de Nueva York y del Centro Oncológico Laura e Isaac Perlmutter de Langone de la Universidad de Nueva York, y el escáner multiespectral Vectra Polaris se compró a través de una Subvención de Instrumento Compartido S10 OD021747. También agradecemos al Programa de Patógenos Resistentes a los Antimicrobianos (AMR) de NYU Langone y a Adriana Heguy y al equipo del Centro de Tecnología del Genoma de NYU por la secuenciación profunda de todos los virus utilizados en este estudio. La investigación fue parcialmente financiada por las siguientes subvenciones de NIH/NIAID: R01AI143639 a MD, K08AI141759 a MBO, R01AI143861 a KMK, DK093668 a KC y T32AI007180. Ninguno de los trabajos con SARS-CoV-2 recombinante en la Facultad de Medicina Grossman de la Universidad de Nueva York fue financiado por el NIAID. El trabajo contó además con el apoyo del Instituto Vilcek de Graduados en Ciencias Biomédicas y de los fondos iniciales de la Facultad de Medicina Grossman de la Universidad de Nueva York.

Estos autores contribuyeron igualmente: Bruno A. Rodríguez-Rodríguez, Grace O. Ciabattoni.

Estos autores supervisaron conjuntamente este trabajo: Mila B Ortigoza, Meike Dittmann.

Departamento de Microbiología, Facultad de Medicina Grossman de la Universidad de Nueva York, Nueva York, NY, 10016, EE. UU.

Bruno A. Rodriguez-Rodriguez, Grace O. Ciabattoni, Ralf Duerr, Ana M. Valero-Jimenez, Stephen T. Yeung, Keaton M. Crosse, Austin R. Schinlever, Lucie Bernard-Raichon, Joaquin Rodriguez Galvan, Kamal M. Khanna, Mila B. Ortigoza & Meike Dittmann

Departamento de Medicina/División de Enfermedades Infecciosas e Inmunología, Facultad de Medicina Grossman de la Universidad de Nueva York, Nueva York, NY, 10016, EE. UU.

Ralf Duerr, Ludovic Desvignes & Mila B. Ortigoza

Centro de Vacunas, NYU Grossmann of Medicine, Nueva York, NY, 10016, EE. UU.

Ralf Duerr

Departamento de Microbiología e Inmunología, Centro de Investigación de Patógenos, Facultad de Medicina de la Universidad de Maryland, Baltimore, MD, 21201, EE. UU.

Marisa E. McGrath y Matthew B. Frieman

Departamento de Biología Sintética y Bioenergía, Instituto J. Craig Venter, Rockville, MD, 20850, EE. UU.

Sanjay Vashee y Yong Xue

Departamento de Patología, Facultad de Medicina Grossman de la Universidad de Nueva York, Nueva York, NY, 10016, EE. UU.

Cynthia Loomis

Perlmutter Cancer Center, Langone Health de la Universidad de Nueva York, Nueva York, NY, 10016, EE. UU.

Kamal Khanna

División de Gastroenterología y Hepatología, Departamento de Medicina, Facultad de Medicina Perelman de la Universidad de Pensilvania, Filadelfia, PA, 19104, EE. UU.

Ken Cadwell

Departamento de Farmacología de Sistemas y Terapéutica Traslacional, Facultad de Medicina Perelman de la Universidad de Pensilvania, Filadelfia, PA, 19104, EE. UU.

Ken Cadwell

Departamento de Patología y Medicina de Laboratorio, Facultad de Medicina Perelman de la Universidad de Pensilvania, Filadelfia, PA, 19104, EE. UU.

Ken Cadwell

Laboratorios de alta contención: Oficina de ciencia e investigación, NYU Langone Health, Nueva York, NY, 10016, EE. UU.

Ludovic Desvignes

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

BAR-R.: Conceptualización, Metodología, Validación, Análisis formal, Investigación, Escritura – Borrador original, Visualización. GOC: Conceptualización, Metodología, Validación, Análisis formal, Investigación, Escritura – Revisión y Edición, Visualización. RD: Conceptualización, Metodología, Validación, Análisis formal, Investigación, Escritura – Revisión y Edición, Visualización. AMV-J.: Conceptualización, Metodología, Investigación, Redacción – Revisión y Edición. STY: Metodología, Investigación, Redacción - Revisión y Edición. KMC: Conceptualización, Metodología, Investigación, Redacción – Revisión y Edición. ARS: Metodología, Investigación, Redacción – Revisión y Edición. LB-R.: Conceptualización, Metodología, Investigación, Redacción – Revisión y Edición. JJRG: Metodología, Investigación, Redacción – Revisión y Edición. MEM: Metodología, Recursos, Redacción – Revisión y Edición. SV: Metodología, Recursos. Yong Xue: Metodología, Recursos. Cynthia Loomis: Metodología, Supervisión. KMK: Metodología, Supervisión, Adquisición de Financiamiento. Kenneth Cadwell: metodología, supervisión, adquisición de fondos. Ludovic Desvignes: Metodología, Recursos, Supervisión, Redacción – Revisión y Edición. Matthew B. Frieman: conceptualización, metodología, recursos, supervisión, adquisición de fondos, redacción, revisión y edición. Mila B Ortigoza: Conceptualización, Metodología, Análisis formal, Investigación, Redacción – Borrador original, Visualización, Supervisión, Adquisición de financiamiento. Meike Dittmann: Conceptualización, Metodología, Análisis formal, Investigación, Redacción – Borrador original, Visualización, Supervisión, Adquisición de financiación.

Correspondencia a Mila B. Ortigoza o Meike Dittmann.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Nicole M. Bouvier y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Un archivo de revisión por pares está disponible.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso Abierto Este artículo está bajo una Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, compartir, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito apropiado a los autores originales y a la fuente. proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Rodríguez-Rodríguez, BA, Ciabattoni, GO, Duerr, R. et al. Un modelo de ratón neonatal caracteriza la transmisibilidad de las variantes del SARS-CoV-2 y revela el papel de ORF8. Nat Comuna 14, 3026 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-38783-0

Descargar cita

Recibido: 21 de octubre de 2022

Aceptado: 15 de mayo de 2023

Publicado: 25 de mayo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-38783-0

Cualquier persona con la que compartas el siguiente enlace podrá leer este contenido:

Lo sentimos, actualmente no hay un enlace para compartir disponible para este artículo.

Proporcionado por la iniciativa de intercambio de contenidos Springer Nature SharedIt

Al enviar un comentario, acepta cumplir con nuestros Términos y pautas de la comunidad. Si encuentra algo abusivo o que no cumple con nuestros términos o pautas, márquelo como inapropiado.